Programmable Protein Reference Standards for benchmarking sub-10 nm Fluorescence Microscopy

تخيل أنك تحاول قياس المسافة بين ذرتي غبار صغيرتين تطفوان في غرفة، لكنك لا تستطيع رؤيتهما إلا من خلال نافذة ضبابية. قد تعتقد أنك تعرف مكانهما بدقة، لكن الضباب (حدود عينيك) والطريقة التي يرتد بها الغبار عن الزجاج (كيف يتصرف الضوء) قد يخدعانك. هذا هو التحدي اليومي للعلماء الذين يستخدمون مجاهر فائقة الدقة. هذه الأدوات القوية تسمح لنا برؤية الأشياء داخل الخلايا التي هي أصغر من الفيروس، كاسرةً بذلك حاجز "النافذة الضبابية" الذي كان يوقفنا سابقًا. ومع ذلك، كلما اقتربنا من قياس أشياء تفصل بينها بضعة نانومترات فقط (النانومتر هو جزء من مليار من المتر)، تظهر مشكلات جديدة. فأحيانًا، تتفاعل الملصقات التي نضعها على الجزيئات لتجعلها تتوهج مع بعضها البعض، مما يغير طريقة وميضها أو لمعانها. وفي أحيان أخرى، يكون "الخيط" الذي يمسك الملصق المتوهج بالجزيء طويلاً جداً، مما يجعل الجزيء يبدو في مكان خاطئ. ولحل هذه المشكلة، يحتاج العلماء إلى "مسطرة" يمكنهم الوثوق بها—شيء صغير ومثالي الشكل والحجم لاختبار ما إذا كان المجهر يخبرهم بالحقيقة.

لفترة طويلة، استخدم العلماء نوعين رئيسيين من المساطر. أحدهما مصنوع من الحمض النووي (DNA)، والذي يمكن طيه في أشكال دقيقة للغاية، مثل فن الأوريغامي. والآخر مصنوع من أجزاء خلوية طبيعية، مثل الأنفاق الصغيرة في نواة الخلية. لكن مساطر الحمض النووي تبدو وكأنها ألعاب بلاستيكية؛ فهي لا تتصرف مثل البروتينات اللينة والمرنة التي تتكون منها الخلايا الحقيقية. أما أجزاء الخلايا الطبيعية فهي فوضوية؛ إذ لا يمكنك تغيير شكلها بسهل لتجربة مسافات مختلفة. وهنا يأتي دور فريق جديد من الباحثين الذي قدم حلاً ذكياً: لقد صنعوا "مسطرة بروتينية قابلة للبرمجة" تشبه الشيء الحقيقي ولكن يمكن ضبطها مثل موجات الراديو.

حلقة البروتين التي تلعب الغميضة

ابتكر العلماء، بقيادة جيرتي بيليو وماركوس ساور، نوعاً جديداً من المعايير المرجعية يسمى "cTRP PicoRuler". فكر في هذا كحلقة بروتينية مجوفة وصغيرة، يبلغ عرضها حوالي 10 نانومترات—أي تقريباً بحجم فيروس صغير. داخل أنبوب اختبار، تبدو هذه الحلقات مثل أطواق "هولا هوب" مثالية وغير مرئية. لكن السحر يحدث عندما يقرر العلماء عدد الملصقات "المضيئة في الظلام" (الفلوروفورات) التي سيضعونها ومكان وضعها بالضبط.

باستخدام تقنية تسمى "توسيع الشفرة الوراثية"، أعادوا كتابة دليل التعليمات لهذه البروتينات. فبدلاً من الأحماض الأمينية العشرين المعتادة (لبنات بناء الحياة)، قاموا بإدخال لبنات بناء خاصة ومصنوعة خصيصاً تعمل مثل خطافات صغيرة. تسمح هذه الخطافات لهم بتثبيت الأصباغ الفلورية بدقة جراحية. لقد بنوا عائلة كاملة من هذه الحلقات: بعضها يحتوي على ملصق واحد فقط، وبعضها باثنين، وثلاثة، وأربعة، وحتى ستة. كما صنعوا بعض الحلقات حيث تكون الملصقات متجمعة بالقرب من بعضها البعض، وأخرى حيث تكون منتشرة حول الحلقة.

لماذا يهم "الوميض"؟

بمجرد بناء هذه الحلقات، وضعوها تحت مجهر فائق الدقة ليروا كيف تتصرف. وهنا يأتي الجزء المثير للدهشة: لم تكن الملصقات تجلس هناك وتلمع فحسب، بل كانت تومض (تضيء وتنطفئ). وجد الباحثون أن طريقة وميض هذه الملصقات تعتمد كلياً على مدى قربها من بعضها البعض.

تخيل مجموعة من الأصدقاء يحاولون التحدث مع بعضهم البعض في غرفة مزدحمة. إذا كانوا يقفون بعيدين عن بعضهم، يمكنهم جميعاً الصراخ في وقت واحد دون مشاكل. ولكن إذا تجمعوا في دائرة ضيقة، فقد يغطون على أصوات بعضهم البعض بالخطأ أو يتشتت انتباههم بسبب الشخص الموجود بجانبهم. وبالمثل، عندما كانت الملصقات الفلورية على حلقة البروتين متراصة معاً، تفاعلت مع بعضها البعض، مما غير سرعة وميضها وعدد المرات التي يستطيع المجهر "رؤيتها" فيها. أظهر الباحثون أنه من خلال قياس أنماط الوميض هذه، يمكنهم معرفة كيفية ترتيب الملصقات بدقة. وهذا يثبت أن حلقات البروتين هذه ليست مجرد مساطر ثابتة؛ بل هي موضوعات اختبار ديناميكية تكشف كيف تؤثر المسافات المتناهية الصغر على سلوك الضوء.

اختبار المسطرة في العالم الحقيقي

للتأكد من أن هذه المساطر تعمل في سيناريوهات الحياة الواقعية، لم يكتفِ الفريق بإبقائها في وعاء، بل قاموا بتثبيت الحلقات على سطح خلايا حية، محاكيين بذلك كيفية استقرار البروتينات على جلد الخلية. بل تمكنوا أيضاً من تنمية الحلقات مباشرة على سطح الخلية باستخدام آليات الخلية نفسها. وفي كلتا الحالتين، تصرفت الحلقات تماماً كما هو متوقع، مما أثبت قدرتها على التعامل مع البيئة المزدحمة والفوضوية داخل الخلية الحية.

كما اختبروا هذه الحلقات في "مجهر التوسع" (Expansion Microscopy)، وهي تقنية يتم فيها نقع العينة في هلام (جل) يتمدد، مما يؤدي إلى تمديد العينة مثل قطعة "التوفي" لجعل الأشياء الصغيرة أسهل في الرؤية. وبعد أن قام الهلام بتوسيع حلقات البروتين بمقدار ثمانية إلى عشرة أضعاف، استطاع العلماء رؤية شكل الحلقة والمسافات المحددة بين الملصقات. وهذا أمر بالغ الأهمية لأنه يظهر أن مساطر البروتين هذه يمكنها الصمود في عملية التمدد، مما يجعلها مثالية لمعايرة هذا النوع المحدد من التصوير عالي التقنية.

الخلاصة

لا تدعي هذه الورقة البحثية أنها حلت كل مشكلات المجهر، لكنها تقدم أداة قوية. لقد أثبت الباحثون أن حلقات البروتين الدائرية هذه هي وسيلة موثوقة وقابلة للبرمجة للتحقق مما إذا كان المجهر يقيس المسافات بشكل صحيح. لقد أثبتوا أنه يمكن بناء الحلقات بعدد مختلف من الملصقات، وأن الملصقات تتفاعل بطرق يمكن التنبؤ بها بناءً على المسافات بينها، وأن الحلقات تعمل في كل من المحاليل النقية والخلايا الحية. ومن خلال توفير معيار "شبيه بالبروتين" يتمتع بدقة مسطرة الحمض النووي، تمنح "cTRP PicoRulers" العلماء طريقة أفضل لضمان دقة قياساتهم في العالم المجهري، مما يساعدنا على فهم البنية الحقيقية للحياة على مقياس النانو.