Programmable Protein Reference Standards for benchmarking sub-10 nm Fluorescence Microscopy

Stel je voor dat je de afstand probeert te meten tussen twee minuscule stofjes die in een kamer rondzweven, maar je kunt ze alleen zien door een beslagen raam. Je zou kunnen denken dat je precies weet waar ze zijn, maar de mist (de beperkingen van je ogen) en de manier waarop het stof tegen het glas weerkaatst (hoe het licht zich gedraagt) zouden je kunnen misleiden. Dit is de dagelijkse uitdaging voor wetenschappers die superresolutie-microscopen gebruiken. Deze krachtige instrumenten laten ons dingen zien binnen cellen die kleiner zijn dan een virus, waardoor ze de barrière van het "beslagen raam" doorbreken die ons voorheen tegenhield. Echter, naarmate we dichter bij het meten van zaken komen die slechts een paar nanometers uit elkaar liggen (een nanometer is een miljardste van een meter), ontstaan er nieuwe problemen. Soms interageren de labels die we op moleculen plakken om ze te laten gloeien met elkaar, wat verandert hoe ze knipperen of schijnen. Op andere tijden is de "draad" die het lichtgevende label aan het molecuul vasthoudt te lang, waardoor het molecuul lijkt te staan op de verkeerde plek. Om dit op te lossen, hebben wetenschappers een "liniaal" nodig die ze kunnen vertrouwen—een minuscuul, perfect object met een bekende vorm en grootte om te testen of hun microscoop de waarheid spreekt.

Lange tijd hebben wetenschappers twee hoofdtypen linialen gebruikt. De ene is gemaakt van DNA, dat in ongelooflijk precieze vormen gevouwen kan worden, zoals origami. De andere is gemaakt van natuurlijke celonderdelen, zoals de piepkleine tunnels in de kern van een cel. Maar DNA-linialen voelen een beetje als plastic speeltjes; ze gedragen zich niet zoals de zachte, veerkrachtige eiwitten waar echte cellen uit bestaan. En natuurlijke celonderdelen zijn rommelig; je kunt hun vorm niet gemakkelijk veranderen om verschillende afstanden te testen. Hier komt een nieuw team van onderzoekers met een slimme oplossing: ze hebben een "programmeerbare eiwitliniaal" gebouwd die aanvoelt als het echte werk, maar die afgestemd kan worden als een radiozender.

De eiwitring die verstoppertje speelt

De wetenschappers, onder leiding van Gerti Beliu en Markus Sauer, hebben een nieuw soort referentiestandaard gecreëerd genaamd een "cTRP PicoRuler". Denk aan deze als een kleine, holle eiwitring, ongeveer 10 nanometer breed—ongeveer de grootte van een klein virus. In een reageerbuis zijn deze ringen als perfecte, onzichtbare hoepels. Maar de magie gebeurt wanneer de wetenschappers beslissen hoeveel "glow-in-the-dark" stickers (fluoroforen) ze op de ringen plaatsen en precies waar ze die plaatsen.

Met behulp van een techniek genaamd "genetic code expansion" hebben ze de instructiehandleiding van deze eiwitten herschreven. In plaats van de gebruikelijke 20 aminozuren (de bouwstenen van het leven), hebben ze speciale, op maat gemaakte bouwstenen ingevoegd die fungeren als kleine haakjes. Deze haakjes stellen hen in staat om fluorescerende kleurstoffen met chirurgische precisie vast te klikken. Ze hebben een hele familie van deze ringen gebouwd: sommige met slechts één sticker, sommige met twee, drie, vier en zelfs zes. Ze maakten ook enkele waarbij de stickers dicht bij elkaar gegroepeerd waren en andere waar ze verspreid over de ring zaten.

Waarom het "knipperen" ertoe doet

Toen ze deze ringen hadden gebouwd, plaatsten ze ze onder een superresolutie-microscoop om te zien hoe ze zich gedroegen. Hier is het verrassende deel: de stickers bleven niet alleen daar zitten en schijnen. Ze knipperden aan en uit. De onderzoekers ontdekten dat de manier waarop deze stickers knipperden volledig afhankelijk was van hoe dicht ze bij elkaar waren.

Stel je een groep vrienden voor die proberen met elkaar te praten in een drukke kamer. Als ze ver uit elkaar staan, kunnen ze allemaal tegelijk schreeuwen zonder problemen. Maar als ze in een nauwe cirkel bij elkaar staan, kunnen ze elkaar per ongeluk overstemmen of worden ze afgeleid door de persoon naast hen. Zoals die stickers op de eiwitring ook dicht op elkaar gepakt zaten, zo interageerden ze met elkaar, wat veranderde hoe snel ze knipperden en hoe vaak de microscoop ze kon "zien". De onderzoekers toonden aan dat ze door deze knippercycli te meten, precies konden zien hoe de stickers waren gerangschikt. Dit bewijst dat deze eiwitringen niet alleen statische linialen zijn; het zijn dynamische proefobjecten die onthullen hoe minuscule afstanden de manier waarop licht zich gedraagt beïnvloeden.

De liniaal testen in de echte wereld

Om te controleren of deze linialen werken in reële scenario's, hielden de onderzoekers ze niet alleen in een potje. Ze bevestigden de ringen aan het oppervlak van levende cellen, waarmee ze de manier nabootsten waarop eiwitten op de huid van een cel zitten. Ze slaagden er zelfs in om de ringen direct op het celoppervlak te laten groeien met behulp van de eigen machinerie van de cel. In beide gevallen gedroegen de ringen zich precies zoals verwacht, wat bewees dat ze de rommelige, drukke omgeving van een levende cel aankunnen.

Ze testten deze ringen ook in "Expansion Microscopy", een techniek waarbij wetenschappers een monster weken in een gel die opzwelt, waardoor het monster wordt uitgerekt als een stuk taffy (snoepgoed), om minuscule dingen gemakkelijker zichtbaar te maken. Nadat de gel de eiwitringen ongeveer acht tot tien keer had uitgezet, konden de wetenschappers de ringvorm en de specifieke afstand tussen de stickers nog steeds zien. Dit is een grote zaak, want het laat zien dat deze eiwitlinialen het rekproces kunnen overleven, waardoor ze perfect zijn voor het kalibreren van dit specifieke type hoogwaardige beeldvorming.

De kern van het verhaal

Dit artikel beweert niet dat het alle problemen in de microscopie heeft opgelost, maar het biedt een krachtig nieuw hulpmiddel. De onderzoekers hebben aangetoond dat deze circulaire eiwitringen een betrouwbare, programmeerbare manier zijn om te controleren of een microscoop afstanden correct meet. Ze bewezen dat de ringen gebouwd kunnen worden met verschillende aantallen labels, dat de labels op voorspelbare manieren met elkaar interageren op basis van hun afstand, en dat de ringen werken in zowel gezuiverde oplossingen als in levende cellen. Door een "eiwit-achtige" standaard te bieden die even precies is als een DNA-liniaal, geven deze cTRP PicoRulers wetenschappers een betere manier om te garanderen dat hun metingen van de microscopische wereld accuraat zijn, wat hels bij de oprechte architectuur van het leven op nanoschaal.