Programmable Protein Reference Standards for benchmarking sub-10 nm Fluorescence Microscopy

Immagina di cercare di misurare la distanza tra due minuscoli granelli di polvere che fluttuano in una stanza, ma di poterli vedere solo attraverso una finestra appannata. Potresti pensare di sapere esattamente dove si trovano, ma la nebbia (i limiti dei tuoi occhi) e il modo in cui la polvere rimbalza sul vetro (come si comporta la luce) potrebbero ingannarti. Questa è la sfida quotidiana per gli scienziati che utilizzano i microscopi a super-risoluzione. Questi potenti strumenti ci permettono di vedere cose all'interno delle cellule che sono più piccole di un virus, abbattendo la barriera della "finestra appannata" che un tempo ci fermava. Tuttavia, man mano che ci avviciniamo alla misurazione di oggetti distanti solo pochi nanometri (un nanometro è un miliardesimo di metro), emergono nuovi problemi. A volte, le etichette che attacchiamo alle molecole per farle brillare interagiscono tra loro, cambiando il modo in cui lampeggiano o splendono. Altre volte, la "corda" che tiene l'etichetta luminosa alla molecola è troppo lunga, facendo apparire la molecola nel posto sbagliato. Per risolvere questo problema, gli scienziati hanno bisogno di un "righello" di cui possano fidarsi: un oggetto minuscolo e perfetto, con una forma e una dimensione note, per testare se il loro microscopio dice la verità.

Per molto tempo, gli scienziati hanno utilizzato due tipi principali di righelli. Uno è fatto di DNA, che può essere ripiegato in forme incredibilmente precise, come l'origami. L'altro è fatto di parti cellulari naturali, come i minuscoli tunnel in un nucleo cellulare. Ma i righelli di DNA sembrano un po' come giocattoli di plastica; non si comportano come le proteine morbide e flessibili che compongono le vere cellule. E le parti cellulari naturali sono disordinate; non puoi cambiare facilmente la loro forma per testare diverse distanze. È qui che un nuovo team di ricercatori interviene con una soluzione ingegnosa: hanno costruito un "righello proteico programmabile" che è simile al vero, ma che può essere regolato come la manopola di una radio.

L'anello proteico che gioca a nascondino

Gli scienziati, guidati da Gerti Beliu e Markus Sauer, hanno creato un nuovo tipo di standard di riferimento chiamato "cTRP PicoRuler". Immaginate questo come un piccolo anello proteico cavo, largo circa 10 nanometri — circa le dimensioni di un piccolo virus. All'interno di una provetta, questi anelli sono come cerchi per l'hula hoop perfetti e invisibili. Ma la magia avviene quando gli scienziati decidono quanti adesivi "luminosi" (fluorofori) mettere su di essi e dove posizionarli esattamente.

Utilizzando una tecnica chiamata "espansione del codice genetico", hanno riscritto il manuale di istruzioni di queste proteine. Invece dei soliti 20 amminoacidi (i mattoni della vita), hanno inserito componenti speciali, creati su misura, che agiscono come piccoli ganci. Questi ganci permettono loro di agganciare coloranti fluorescenti con precisione chirurgica. Hanno costruito un'intera famiglia di questi anelli: alcuni con un solo adesivo, altri con due, tre, quattro e persino sei. Hanno anche creato alcuni anelli in cui gli adesivi erano raggruppati vicini e altri in cui erano distribuiti intorno all'anello.

Perché il "lampeggiare" è importante

Una volta costruiti questi anelli, li hanno posti sotto un microscopio a super-risoluzione per vedere come si comportavano. Ecco la parte sorprendente: gli adesivi non stavano solo lì a splendere. Lampeggiavano, accendendosi e spegnendosi. I ricercatori hanno scoperto che il modo in cui questi adesivi lampeggiano dipende interamente da quanto sono vicini tra loro.

Immaginate un gruppo di amici che cerca di parlare tra loro in una stanza affollata. Se sono lontani, possono tutti gridare contemporaneamente senza problemi. Ma se si radunano in un cerchio stretto, potrebbero accidentalmente coprire le voci degli altri o distrarsi per via della persona accanto a loro. Allo stesso modo, quando gli adesivi fluorescenti sull'anello proteico erano impacchettati strettamente, interagivano tra loro, cambiando la velocità con cui lampeggiavano e quante volte il microscopio poteva "vederli". I ricercatori hanno dimostrato che, misurando questi schemi di lampeggio, potevano capire esattamente come fossero disposti gli adesivi. Questo dimostra che questi anelli proteici non sono solo righelli statici; sono soggetti dinamici che rivelano come le minuscole distanze influenzino il comportamento della luce.

Testare il righello nel mondo reale

Per assicurarsi che questi righelli funzionino in scenari reali, il team non li ha tenuti semplicemente in un barattolo. Hanno attaccato gli anelli alla superficie di cellule viventi, imitando il modo in cui le proteine si trovano sulla pelle di una cella. Sono riusciti persino a far crescere gli anelli direttamente sulla superficie cellulare usando il macchinario della cella stessa. In entrambi i casi, gli anelli si sono comportati esattamente come previsto, dimostrando di poter gestire l'ambiente disordinato e affollato di una cella vivente.

Hanno anche testato questi anelli nella "Microscopia a Espansione", una tecnica in cui gli scienziati immergono un campione in un gel che si gonfia, allungando il campione come se fosse caramella mou per rendere le cose minuscole più facili da vedere. Dopo che il gel ha espanso gli anelli proteici di circa otto o dieci volte, gli scienziati riuscivano ancora a vedere la forma dell'anello e la specifica spaziatura degli adesivi. Questo è un grande traguardo perché dimostra che questi righelli proteici possono sopravvivere al processo di allungamento, rendendoli perfetti per calibrare questo specifico tipo di imaging ad alta tecnologia.

Il punto fondamentale

Questo articolo non sostiene di aver risolto ogni problema della microscopia, ma offre uno strumento potente. I ricercatori hanno dimostrato che questi anelli proteici circolari sono un modo affidabile e programmabile per verificare se un microscopio sta misurando correttamente le distanze. Hanno provato che gli anelli possono essere costruiti con diversi numeri di etichette, che le etichette interagiscono in modi prevedibili in base alla loro spaziatura e che gli anelli funzionano sia in soluzioni purificate che in cellule viventi. Fornendo uno standard "simile alle proteine" che è preciso come un righello di DNA, i cTRP PicoRulers offrono agli scienziati un modo migliore per garantire che le loro misurazioni del mondo microscopico siano accurate, aiutandoci a comprendere la vera architettura della vita alla scala nanometrica.