Programmable Protein Reference Standards for benchmarking sub-10 nm Fluorescence Microscopy

Imagina que estás intentando medir la distancia entre dos diminutas motas de polvo que flotan en una habitación, pero solo puedes verlas a través de una ventana empañada. Podrías pensar que sabes exactamente dónde están, pero la niebla (los límites de tus ojos) y la forma en que el polvo rebota contra el cristal (cómo se comporta la luz) podrían engañarte. Este es el desafío diario para los científicos que utilizan microscopios de superresolución. Estas poderosas herramientas nos permiten ver cosas dentro de las células que son más pequeñas que un virus, rompiendo la barrera de la "ventana empañada" que antes nos detenía. Sin embargo, a medida que nos acercamos a medir cosas separadas por apenas unos pocos nanómetros (un nanómetro es una milmillonésima parte de un metro), surgen nuevos problemas. A veces, las etiquetas que pegamos en las moléculas para que brillen interactúan entre sí, cambiando cómo parpadean o cómo brillan. Otras veces, la "cuerda" que sujeta la etiqueta brillante a la molécula es demasiado larga, haciendo que la molécula parezca estar en el lugar equivocado. Para solucionar esto, los científicos necesitan una "regla" en la que puedan confiar: un objeto diminuto y perfecto con una forma y un tamaño conocidos para comprobar si su microscopio les está diciendo la verdad.

Durante mucho tiempo, los científicos han utilizado dos tipos principales de reglas. Una está hecha de ADN, que puede plegarse en formas increíblemente precisas, como el origami. La otra está hecha de partes naturales de la célula, como los diminutos túneles en el núcleo de una célula. Pero las reglas de ADN se sienten un poco como juguetes de plástico; no se comportan como las proteínas suaves y blandas que componen las células reales. Y las partes naturales de la célula son desordenadas; no puedes cambiar fácilmente su forma para probar diferentes distancias. Aquí es donde un nuevo equipo de investigadores interviene con una solución ingeniosa: construyeron una "regla de proteína programable" que se siente como la real, pero que puede ajustarse como el dial de una radio.

El anillo de proteína que juega al escondite

Los científicos, liderados por Gerti Beliu y Markus Sauer, crearon un nuevo tipo de estándar de referencia llamado "cTRP PicoRuler". Piensa en esto como un anillo de proteína hueco y diminuto, de unos 10 nanómetros de ancho, aproximadamente el tamaño de un pequeño virus. Dentro de un tubo de ensayo, estos anillos son como hula-hoops perfectos e invisibles. Pero la magia ocurre cuando los científicos deciden cuántas pegatinas "brillantes en la oscuridad" (fluoróforos) poner en ellos y exactamente dónde colocarlas.

Utilizando una técnica llamada "expansión del código genético", reescribieron el manual de instrucciones de estas proteínas. En lugar de los 20 aminoácidos habituales (los bloques de construcción de la vida), insertaron bloques de construcción especiales y personalizados que actúan como diminutos ganchos. Estos ganchos les permiten enganchar tintes fluorescentes con precisión quirúrgica. Construyeron toda una familia de estos anillos: algunos con solo una pegatina, otros con dos, tres, cuatro e incluso seis. También hicieron algunos donde las pegatinas estaban agrupadas muy juntas y otros donde estaban repartidas alrededor del anillo.

Por qué el "parpadeo" es importante

Una vez construidos estos anillos, los pusieron bajo un microscopio de superresolución para ver cómo se comportaban. Aquí está la parte sorprendente: las pegatinas no solo se sentaban allí y brillaban. Parpadeaban, encendiéndose y apagándose. Los investigadores descubrieron que la forma en que estas pegatinas parpadeaban dependía enteramente de qué tan cerca estaban unas de otras.

Imagina a un grupo de amigos intentando hablar entre sí en una habitación llena de gente. Si están lejos unos de otros, todos pueden gritar a la vez sin problemas. Pero si se amontonan en un círculo apretado, podrían distraerse accidentalmente con la voz de la persona de al lado o cubrirse las voces unos a otros. Del mismo modo, cuando las pegatinas fluorescentes en el anillo de proteína estaban muy juntas, interactuaban entre sí, cambiando la velocidad con la que parpadeaban y cuántas veces el microscopio podía "verlas". Los investigadores demostraron que, al medir estos patrones de parpadeo, podían saber exactamente cómo estaban dispuestas las pegatinas. Esto demuestra que estos anillos de proteína no son solo reglas estáticas; son sujetos de prueba dinámicos que revelan cómo las distancias diminutas afectan la forma en que se comporta la luz.

Probando la regla en el mundo real

Para asegurar que estas reglas funcionen en escenarios de la vida real, el equipo no se limitó a mantenerlas en un frasco. Unieron los anillos a la superficie de células vivas, imitando cómo las proteínas se asientan en la piel de una célula. Incluso lograron cultivar los anillos directamente en la superficie celular utilizando la propia maquinaria de la célula. En ambos casos, los anillos se comportaron exactamente como se esperaba, demostrando que pueden manejar el entorno desordenado y congestionado de una célula viva.

También probaron estos anillos en "Microscopía de Expansión", una técnica en la que los científicos sumergen una muestra en un gel que se hincha, estirando la muestra como si fuera un caramelo masticable para que las cosas diminutas sean más fáciles de ver. Después de que el gel expandiera los anillos de proteína aproximadamente ocho o diez veces, los científicos todavía podían ver la forma del anillo y el espaciado específico de las pegatinas. Esto es algo importante porque demuestra que estos anillos de proteína pueden sobrevivir al proceso de estiramiento, lo que los convierte en perfectos para calibrar este tipo de imagen de alta tecnología.

La conclusión

Este artículo no pretende haber resuelto todos los problemas de la microscopía, pero ofrece una herramienta poderosa. Los investigadores han demostrado que estos anillos de proteína circulares son una forma fiable y programable de comprobar si un microscopio está midiendo las distancias correctamente. Demostraron que los anillos se pueden construir con diferentes cantidades de etiquetas, que las etiquetas interactúan de maneras predecibles según su espaciado y que los anillos funcionan tanto en soluciones purificadas como en células vivas. Al proporcionar un estándar "similar a una proteína" que es tan preciso como una regla de ADN, estos cTRP PicoRulers ofrecen a los científicos una mejor manera de asegurar que sus mediciones del mundo microscópico sean precisas, ayudando a comprender la verdadera arquitectura de la vida a escala nanométrica.