Programmable Protein Reference Standards for benchmarking sub-10 nm Fluorescence Microscopy

Imaginez que vous essayiez de mesurer la distance entre deux minuscules grains de poussière flottant dans une pièce, mais que vous ne puissiez les voir qu'à travers une fenêtre embrumée. Vous pourriez penser savoir exactement où ils se trouvent, mais le brouillard (les limites de vos yeux) et la façon dont la poussière rebondit sur la vitre (le comportement de la lumière) pourraient vous tromper. C'est le défi quotidien des scientifiques utilisant les microscopes à super-résolution. Ces outils puissants nous permettent de voir des choses à l'intérieur des cellules qui sont plus petites qu'un virus, brisant ainsi la barrière de la « fenêtre embrumée » qui nous arrêtait autrefois. Cependant, à mesure que nous nous rapprochons de la mesure d'objets séparés de seulement quelques nanomètres (un nanomètre est un milliardième de mètre), de nouveaux problèmes apparaissent. Parfois, les étiquettes que nous apposons sur les molécules pour les faire briller interagissent entre elles, modifiant la façon dont elles clignotent ou brillent. D'autres fois, le « fil » qui retient l'étiquette brillante à la molécule est trop long, ce qui fait que la molécule semble être au mauvais endroit. Pour corriger cela, les scientifiques ont besoin d'une « règle » en laquelle ils peuvent avoir confiance — un objet minuscule et parfait, de forme et de taille connues, pour tester si leur microscope dit la vérité.

Pendant longtemps, les scientifiques ont utilisé deux principaux types de règles. L'une est faite d'ADN, qui peut être plié en formes incroyablement précises, comme de l'origami. L'autre est faite de parties cellulaires naturelles, comme les minuscules tunnels dans le noyau d'une cellule. Mais les règles d'ADN ressemblent un peu à des jouets en plastique ; elles ne se comportent pas comme les protéines molles et élastiques qui composent les vraies cellules. Et les parties cellulaires naturelles sont désordonnées ; vous ne pouvez pas facilement changer leur forme pour tester différentes distances. C'est ici qu'une nouvelle équipe de chercheurs intervient avec une solution ingénieuse : ils ont construit une « règle protéique programmable » qui ressemble à la réalité, mais qui peut être réglée comme le cadran d'une radio.

L'anneau protéique qui joue à cache-cache

Les scientifiques, dirigés par Gerti Beliu et Markus Sauer, ont créé un nouveau type de standard de référence appelé « cTRP PicoRuler ». Considérez cela comme un minuscule anneau protéique creux, d'environ 10 nanomètres de large — environ la taille d'un petit virus. Dans un tube à essai, ces anneaux sont comme des cerceaux parfaits et invisibles. Mais la magie opère lorsque les scientifiques décident du nombre d'autocollants « phosphorescents » (fluorophores) qu'ils vont mettre sur eux et de l'endroit exact où les placer.

En utilisant une technique appelée « expansion du code génétique », ils ont réécrit le manuel d'instructions de ces protéines. Au lieu des 20 acides aminés habituels (les briques élémentaires de la vie), ils ont inséré des blocs de construction spéciaux, fabriqués sur mesure, qui agissent comme de minuscules crochets. Ces crochets leur permettent de fixer des colorants fluorescents avec une précision chirurgicale. Ils ont construit toute une famille de ces anneaux : certains avec un seul autocollant, d'autres avec deux, trois, quatre et même six. Ils ont également fabriqué certains anneaux où les autocollants étaient regroupés étroitement et d'autres où ils étaient dispersés autour de l'anneau.

Pourquoi le « clignotement » est important

Une fois ces anneaux construits, ils les ont placés sous un microscope à super-résolution pour voir comment ils se comportaient. Voici la partie surprenante : les autocollants ne se contentaient pas de rester là et de briller. Ils clignotaient, s'allumant et s'éteignant. Les chercheurs ont découvert que la façon dont ces autocollants clignotaient dépendait entièrement de leur proximité les uns avec les autres.

Imaginez un groupe d'amis essayant de se parler dans une pièce bondée. S'ils sont éloignés, ils peuvent tous crier en même temps sans problème. Mais s'ils sont serrés dans un cercle étroit, ils pourraient accidentellement couvrir les voix des autres ou être distraits par la personne à côté d'eux. De même, lorsque les autocollants fluorescents sur l'anneau protéique étaient serrés les uns contre les autres, ils interagissaient entre eux, modifiant la vitesse à laquelle ils clignotaient et le nombre de fois que le microscope pouvait les « voir ». Les chercheurs ont montré qu'en mesurant ces motifs de clignotement, ils pouvaient déterminer exactement comment les autocollants étaient disposés. Cela prouve que ces anneaux protéiques ne sont pas seulement des règles statiques ; ce sont des sujets dynamiques qui révèlent comment les distances infimes affectent le comportement de la lumière.

Tester la règle dans le monde réel

Pour s'assurer que ces règles fonctionnent dans des scénarios de la vie réelle, l'équipe ne s'est pas contentée de les garder dans un bocal. Ils ont attaché les anneaux à la surface de cellules vivantes, imitant la façon dont les protéines se posent sur la peau d'une cellule. Ils ont même réussi à faire croître les anneaux directement sur la surface cellulaire en utilisant la propre machinerie de la cellule. Dans les deux cas, les anneaux se sont comportés exactement comme prévu, prouvant qu'ils peuvent gérer l'environnement complexe et encombré d'une cellule vivante.

Ils ont également testé ces anneaux dans la « microscopie d'expansion », une technique où les scientifiques imprègnent un échantillon d'un gel qui gonfle, étirant l'échantillon comme du taffy pour rendre les choses minuscules plus faciles à voir. Après que le gel a étiré les anneaux protéiques d'environ huit à dix fois, les scientifiques pouvaient toujours voir la forme de l'anneau et l'espacement spécifique des autocollants. C'est un événement majeur car cela montre que ces règles protéiques peuvent survivre au processus d'étirement, ce qui les rend parfaites pour calibrer ce type spécifique d'imagerie de haute technologie.

L'essentiel à retenir

Cet article ne prétend pas avoir résolu tous les problèmes de la microscopie, mais il offre un nouvel outil puissant. Les chercheurs ont démontré que ces anneaux protéiques circulaires sont un moyen fiable et programmable de vérifier si un microscope mesure correctement les distances. Ils ont prouvé que les anneaux peuvent être construits avec différents nombres d'étiquettes, que les étiquettes interagissent de manière prévisible selon leur espacement, et que les anneaux fonctionnent aussi bien dans des solutions purifiées que dans des cellules vivantes. En fournissant un standard « de type protéine » aussi précis qu'une règle d'ADN, les cTRP PicoRulers donnent aux scientifiques un meilleur moyen de s'assurer que leurs mesures du monde microscopique sont exactes, aidant ainsi à comprendre la véritable architecture de la vie à l'échelle nanométrique.