Programmable Protein Reference Standards for benchmarking sub-10 nm Fluorescence Microscopy

Stellen Sie sich vor, Sie versuchen, den Abstand zwischen zwei winzigen Staubkörnern zu messen, die in einem Raum schweben, aber Sie können sie nur durch ein beschlagenes Fenster sehen. Sie glauben vielleicht, genau zu wissen, wo sie sich befinden, aber der Nebel (die Grenzen Ihrer Augen) und die Art und Weise, wie das Licht vom Glas abprallt (wie das Licht sich verhält), könnten Sie täuschen. Dies ist die tägliche Herausforderung für Wissenschaftler, die Super-Resolution-Mikroskope verwenden. Diese leistungsstarken Werkzeuge lassen uns Dinge innerhalb von Zellen sehen, die kleiner als ein Virus sind, und überwinden damit die „beschlagene Fenster“-Barriere, die uns früher stoppte. Doch während wir uns dem Maß von nur wenigen Nanometern nähern (ein Nanometer ist ein Milliardstel Meter), tauchen neue Probleme auf. Manchmal interagieren die Etiketten, die wir an Moleküle kleben, um sie zum Leuchten zu bringen, miteinander und verändern so, wie sie blinken oder leuchten. Manchmal ist auch der „Faden“, der das leuchtende Etikett am Molekül hält, zu lang, was dazu führt, dass das Molekül an der falschen Stelle erscheint. Um dies zu beheben, benötigen Wissenschaftler ein „Lineal“, dem sie vertrauen können – ein winziges, perfektes Objekt mit bekannter Form und Größe, um zu testen, ob ihr Mikroskop die Wahrheit sagt.

Lange Zeit haben Wissenschaftler zwei Haupttypen von Linealen verwendet. Das eine besteht aus DNA, die zu unglaublich präzisen Formen gefaltet werden kann, ähnlich wie Origami. Das andere besteht aus natürlichen Zellteilen, wie den winzigen Tunneln im Zellkern einer Zelle. Aber DNA-Lineale fühlen sich jedoch eher wie Plastikspielzeug an; sie verhalten sich nicht wie die weichen, elastischen Proteine, aus denen echte Zellen bestehen. Und natürliche Zellteile sind unordentlich; man kann ihre Form nicht einfach ändern, um verschiedene Abstände zu testen. Hier setzt ein neues Forscherteam mit einer cleveren Lösung an: Sie haben ein „programmierbares Protein-Lineal“ gebaut, das sich genau wie das Echte anfühlt, aber wie ein Radiorekler wie ein Radio fein abgestimmt werden kann.

Der Proteinring, der Verstecken spielt

Die Wissenschaftler unter der Leitung von Gerti Beliu und Markus Sauer schufen eine neue Art von Referenzstandard, den „cTRP PicoRuler“. Denken Sie an diesen als einen winzigen, hohlen Proteinring, etwa 10 Nanometer breit – etwa so groß wie ein kleines Virus. In einem Reagenzglas sind diese Ringe wie perfekte, unsichtbare Hula-Hoop-Reifen. Aber die Magie geschieht, wenn die Wissenschaftler entscheiden, wie viele „leuchtende“ Aufkleber (Fluorophore) sie darauf setzen und wo genau sie diese platzieren.

Mithilfe einer Technik namens „Genetic Code Expansion“ haben sie das Handbuch für diese Proteine umgeschrieben. Anstatt der üblichen 20 Aminosäuren (den Bausteinen des Lebens) fügten sie spezielle, maßgeschneiderte Bausteine ein, die wie winzige Haken wirken. Diese Haken ermöglichen es ihnen, fluoreszierende Farbstoffe mit chirurgischer Präzision anzudocken. Sie bauten eine ganze Familie dieser Ringe: einige mit nur einem Aufkleber, einige mit zwei, drei, vier und sogar sechs. Sie fertigten auch solche an, bei denen die Aufkleber eng zusammengeballt waren, und andere, bei denen sie weit um den Ring verteilt waren.

Warum das „Blinken“ wichtig ist

Nachdem sie diese Ringe gebaut hatten, untersuchten sie unter einem Super-Resolution-Mikroskop, wie sie sich verhielten. Hier ist der überraschende Teil: Die Aufkleber saßen nicht einfach nur da und leuchteten. Sie blinkten an und aus. Die Forscher fanden heraus, dass das Blinken dieser Aufkleber vollständig davon abhängt, wie nah sie beieinander liegen.

Stellen Sie sich eine Gruppe von Freunden vor, die versuchen, sich in einem überfüllten Raum zu unterhalten. Wenn sie weit voneinander entfernt stehen, können sie alle gleichzeitig laut rufen, ohne Probleme zu haben. Aber wenn sie sich in einem engen Kreis zusammengedrängt haben, könnten sie sich gegenseitig die Stimme übertönen oder durch die Person neben ihnen abgelenkt werden. Ähnlich verhält es sich, wenn die fluoreszierenden Aufkleber auf dem Proteinring dicht gepackt sind: Sie interagieren miteinander und verändern dadurch, wie schnell sie blinken und wie oft das Mikroskop sie „sieht“. Die Forscher zeigten, dass sie durch die Messung dieser Blinkmuster genau bestimmen können, wie die Aufkleber angeordnet sind. Dies beweist, dass diese Proteinringe nicht nur statische Lineale sind; sie sind dynamische Testobjekte, die offenbaren, wie winzige Abstände die Art und Weise beeinflussen, wie Licht sich verhält.

Das Testen des Lineals in der realen Welt

Um sicherzustellen, dass diese Lineale in realen Szenarien funktionieren, hielten die Forscher sie nicht nur in einem Glas. Sie befestigten die Ringe an der Oberfläche lebender Zellen, um die Art und Weise nachzuahmen, wie Proteine auf der Zelloberfläche sitzen. Sie konnten die Ringe sogar direkt auf der Zelloberfläche unter Verwendung der zelleigenen Maschinerie wachsen lassen. In beiden Fällen verhielten sich die Ringe genau wie erwartet, was beweist, dass sie die unordentliche, überfüllte Umgebung einer lebenden Zelle bewältigen können.

Sie testeten diese Ringe auch in der „Expansionsmikroskopie“, einer Technik, bei der Wissenschaftler eine Probe in ein Gel einweichen, das anschwillt und die Probe wie Kaugummi auseinanderzieht, um winzige Dinge leichter sichtbar zu machen. Nachdem das Gel die Proteinringe um etwa das Acht- bis Zehnfache gedehnt hatte, konnten die Wissenschaftler immer noch die Ringform und den spezifischen Abstand der Aufkleber erkennen. Dies ist eine große Sache, denn es zeigt, dass diese Protein-Lineale den Streckprozess überstehen können, was sie perfekt für die Kalibrierung dieser speziellen Art von Hochtechnologie-Bildgebung macht.

Das Fazit

Dieses Paper behauptet nicht, alle Probleme der Mikroskopie gelöst zu haben, aber es bietet ein leistungsstarkes neues Werkzeug. Die Forscher haben gezeigt, dass diese kreisförmigen Proteinringe ein zuverlässiger, programmierbarer Weg sind, um zu überprüfen, ob ein Mikroskop Abstände korrekt misst. Sie haben bewiesen, dass die Ringe mit unterschiedlicher Anzahl an Markierungen gebaut werden können, dass die Markierungen in Abhängigkeit von ihrem Abstand auf vorhersehbare Weise interagieren und dass die Ringe sowohl in gereinigten Lösungen als auch in lebenden Zellen funktionieren. Indem sie einen „proteinähnlichen“ Standard bereitstellen, der so präzise wie ein DNA-Lineal ist, geben diese cTRP PicoRuler den Wissenschaftlern eine bessere Möglichkeit, sicherzustellen, dass ihre Messungen der mikroskopischen Welt genau sind, was uns hilft, die wahre Architektur des Lebens auf der Nanoskala zu verstehen.