Programmable Protein Reference Standards for benchmarking sub-10 nm Fluorescence Microscopy

あなたは、部屋の中に浮遊する2つの小さな塵の間の距離を測定しようとしていると想像してください。しかし、あなたは霧がかった窓越しにしかそれらを見ることができません。あなたは、それらが正確にどこにあるのかを分かっているつもりかもしれませんが、霧（あなたの目の限界）や、光がガラスに跳ね返る様子（光の振る舞い）が、あなたを欺く可能性があります。これは、超解像顕微鏡を使用する科学者たちが直面している日常的な課題です。これらの強力なツールは、ウイルスよりも小さな細胞内部の構造を見ることができ、かつては私たちを阻んでいた「霧がかった窓」の障壁を打ち破ります。しかし、わずか数ナノメートル（1ナノメートルは10億分の1メートル）の距離を測定しようと近づくと、新たな問題が発生します。時には、分子を光らせるために貼り付けたラベル同士が相互作用し、その点滅や輝き方を変えてしまうことがあります。また、光るラベルを分子に繋ぎ止めている「紐」が長すぎて、分子が間違った位置にあるように見えてしまうこともあります。これを解決するために、科学者たちは「定規」を必要としています。それは、既知の形状とサイズを持つ、極めて精密で完璧な物体である必要があります。

長い間、科学者たちは主に2種類の定規を使用してきました。一つはDNAで作られたもので、DNAは折り紙のように驚くほど精密な形に折り畳むことができます。もう一つは、細胞核の中にある小さなトンネルのような、天然の細胞成分で作られたものです。しかし、DNAの定規は少しプラスチックのおもちゃのような感覚であり、本物の細胞を構成する柔らかく、もちもちとしたタンパク質のような振る舞いはしません。そして、天然の細胞成分は乱雑です。異なる距離をテストするために、その形状を簡単に変えることはできません。ここで、新しい研究チームが巧妙な解決策を持って登場しました。彼らは、本物のように感じられながらも、ラジオのダイヤルのように調整可能な「プログラマブルなタンパク質定規」を作り出したのです。

かくれんぼをするタンパク質のリング

ゲルティ・ベリウとマルクス・ザウアーに率いられた科学者たちは、「cTRP PicoRuler」と呼ばれる新しい種類の参照標準を作りました。これは、直径約10ナノメートル（小さなウイルスのサイズ程度）の、中空のタンパク質のリングだと考えてください。試験管の中では、これらのリングは完璧で目に見えないフラフープのような存在です。しかし、魔法は、科学者がどれだけの数の「暗闇で光る」ステッカー（蛍光色素）を、どの位置に配置するかを決定したときに起こります。

「遺伝暗号拡張法」と呼ばれる技術を用いて、彼らはこれらのタンパク質の設計図を書き換えました。通常の20種類のアミノ酸（生命の構成要素）の代わりに、特殊なカスタムメイドの構成要素を挿入しました。これらは小さなフックのように機能します。このフックによって、外科手術のような精密さで蛍光色素をパチっと取り付けることができるのです。彼らは一連のリングのファミリーを作り上げました。ステッカーが1つだけのもの、2つ、3つ、4つ、さらには6つのものもあります。また、ステッカーが密集して配置されているものもあれば、リングの周囲に広く分散しているものも作りました。

なぜ「点滅」が重要なのか

これらのリングを作り終えた後、彼らはそれらがどのように振る舞うかを観察するために、超解像顕微鏡の下に置きました。ここでの驚きの事実は、ステッカーはただそこに座って光っているだけではなかったということです。ステッカーは点滅していたのです。研究者たちは、これらのステッカーの点滅の仕方は、それらがどれくらい近いかによって完全に依存することを発見しました。

友人たちが混雑した部屋で会話をしようとしている場面を想像してみてください。もし彼らが離れて立っていれば、トラブルもなく全員が同時に叫ぶことができます。しかし、もし彼らが窮屈な円を描いて集まっていれば、互いの声を遮ってしまったり、隣にいる人に気を取られてしまったりするかもしれません。同様に、タンパク質リング上の蛍光ステッカーが密集しているとき、それらは互いに相互作用し、点滅の速さや、顕微鏡がそれらを「見る」ことができる回数を変化させました。研究者たちは、これらの点滅パターンを測定することで、ステッカーがどのように配置されているかを正確に特定できることを示しました。これは、これらのタンパク質リングが単なる静的な定規ではなく、距離が光の振る舞いにどのように影響するかを明らかにする、ダイナミックな被験者であることを証明しています。

実世界での定規のテスト

これらの定規が実世界のシナリオで機能することを確認するために、チームは単に瓶の中に置いておいたわけではありません。彼らはリングを生存細胞の表面に取り付け、タンパク質が細胞の皮膚の上に存在する様子を模倣しました。さらに、細胞自身の機構を使って、細胞表面に直接リングを成長させることにも成功しました。どちらの場合も、リングは予想通りに振る舞い、浄化された溶液中だけでなく、混雑した細胞内の環境でも機能することを証明しました。

彼らはまた、サンプルをゲルに浸して膨らませ、サンプルを taffy（タフィー）のように引き伸ばして、極小のものをより見やすくする技術である「拡張顕微鏡法」においても、これらのリングをテストしました。ゲルがタンパク質リングを約8倍から10倍に拡張した後でも、科学者たちはリングの形状とステッカーの特定の間隔を依然として確認することができました。これは大きな成果です。なぜなら、これらのタンパク質定規が引き伸ばしのプロセスに耐えられることを示しており、この特定の高度なイメージング技術の校正に最適であることを意味しているからです。

結論

この論文は、顕微鏡におけるあらゆる問題を解決したと主張しているわけではありませんが、強力な新しいツールを提示しています。研究者たちは、これらの円形のタンパク質リングが、顕微鏡が距離を正しく測定しているかどうかを確認するための、信頼できるプログラマブルな方法であることを示しました。彼らは、ラベルの数を変えて構築できること、ラベルが間隔に基づいて予測可能な方法で相互作用すること、そして、精製された溶液と生細胞の両方でリングが機能することを証明しました。DNA定規と同じくらい精密な「タンパク質のような」標準を提供することで、cTRP PicoRulerは、科学者がナノスケールにおける生命の真の構造を理解するのを助け、顕微鏡による測定の正確性を確保するためのより良い手段を提示しています。