Fluorescence-lifetime encoding for scalable single-protein-resolution imaging
تقدم هذه الورقة تقنية RE-FLIM، وهي تقنية ترميز لعمر الفلورة تتغلب على قيود القياس التربيعي للطرق السابقة لتحقيق تصوير بدقة البروتين الواحد، مما يتيح تصور بروتومرات ثلاثيات HIV-1 Env الفردية في أغشية الخلايا السليمة.
البحث الأصلي مرخَّص بموجب CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). هذا شرح مولَّده بالذكاء الاصطناعي لبحث مسبق لم يخضع لمراجعة الأقران. وهو ليس نصيحة طبية. لا تتخذ أي قرارات تتعلق بصحتك بناءً على هذا المحتوى. اقرأ إخلاء المسؤولية الكامل
لرؤية آليات الحياة، غالباً ما يلجأ العلماء إلى المجاهر التي يمكنها النظر إلى ما وراء حدود الضوء العادي. لعقود من الزمن، سمحت تقنية تسمى DNA-PAINT للباحثين برسم خرائط لمواقع البروتينات الفردية بدقة تبلغ حوالي 15 نانومترًا. هذا صغير للغاية، ومع ذلك فإن العديد من المعقدات البروتينية، وهي الوحدات الوظيفية التي تدفع العمليات الخلوية، منظمة في مقاييس أصغر من ذلك حتى، وغالبًا ما تفصل بينها بضعة نانومترات فقط. عندما توضع هذه المكونات الصغيرة قريبة جدًا من بعضها البعض، فإن طرق التراكيب الفائقة القياسية تجعلها تبدو كنقطة واحدة غير واضحة، مما يخفي هيكلها الحقيقي. ولحل هذه المشكلة، طور العلماء طريقة تسمى RESI، والتي تعمل كعملية فرز بطيئة ودقيقة؛ فهي تضع علامات على أجزاء مختلفة من البروتين باستخدام وسوم DNA فريدة ثم تقوم بتصويرها وسماً تلو الآخر. ومن خلال الانتظار حتى يومض كل وسم ويخبو بالتتابع، يمكن لهذه الطريقة تحديد مركز كل جزء بدقة متناهية. ومع ذلك، فإن هذا النهج المتسلسل يواجه عقبة رئيسية: فكلما زاد عدد الأجزاء في البروتين، زاد الوقت المطلوب لتصويرها جميعًا بشكل انفجاري، مما يجعل الأمر غير عملي للهياكل الكبيرة والمعقدة.
لقد قدم فريق من الباحثين بقيادة سابرينا سيمونتشيلي من جامعة كوليدج لندن الآن طريقة أسرع وأكثر كفاءة لرؤية هذه التفاصيل الدقيقة، وهي طريقة يسمونها RE-FLIM. فبدلاً من الانتظار لتصوير كل جزء من البروتين واحداً تلو الآخر، تستخدم هذه التقنية الجديدة "عمر" الضوء للتمييز بين الأجزاء المختلفة في وقت واحد. فكل جزيء صبغة فلورية يتوهج لفترة زمنية مختلفة قليလျ بعد تعرضه لليزر قبل أن يتلاشى. ومن خلال قياس هذه المدة الدقيقة، يمكن للمجهر التمييز بين أنواع مختلفة من جزيئات الصبغة حتى عندما تتوهج في نفس الوقت. وقد جمع الباحثون بين قياس العمر هذا وبين المتوسط عالي الدقة لطريقة RESI القديمة، مما سمح لهم بتحديد موقع أجزاء متعددة من البروتين في لقطة واحدة، مما قلل عدد جولات التصوير بمقدار ثلاثة أضعاف مقارنة بأفضل طريقة سابقة.
اختبر الفريق فكرتهم أولاً على هيكل مستطيل مسطح مصنوع من DNA، يُعرف باسم "أوريغامي DNA"، والذي كان بمثابة مسطرة صلبة ومثالية. لقد قاموا بتثبيت أزواج من خيوط الإرساء على هذا الهيكل كانت تفصل بينها مسافة 3.2 نانومتر فقط، وهي مسافة صغيرة جداً لا يمكن لتقنية DNA-PAINT القياسية تمييزها. وباستخدام نوعين مختلفين من الصبغات الفلورية التي تتوهج لفترات زمنية مختلفة، تمكنوا من رؤية كلا الخيطين بوضوح في صورة واحدة. وحددت الطريقة الجديدة موقع كل خيط بدقة تبلغ حوالي 1 نانومتر، وهو تحسن بمقدار ثمانية أضعاف عن التقنية القياسية. وكرروا هذا النجاح مع ترتيب مثلثي أكثر تعقيداً لثلاثة خيوط، تفصل بينها مسافة 5 نانومترات تقريباً؛ وفي هذه الحالة، استخدموا ثلاث صبغات مختلفة في وقت واحد. أظهرت الصور الناتجة بوضوح الزوايا الثلاث المتميزة للمثلث، مما أكد أن الطريقة يمكنها التعامل مع أهداف متعددة في آن واحد دون دمجها معاً.
وتشجيعاً لهذه النتائج على هياكل DNA الاصطناعية، طبق الباحثون تقنية RE-FLIM على هدف بيولوجي حقيقي: وهو بروتين غلاف فيروس نقص المناعة البشرية (HIV-1)، وهو "بروز" موجود على سطح الفيروس ويساعده في إصابة الخلايا. يوجد هذا البروتين في شكل "ثلاثي"، مما يعني أنه يتكون من ثلاث وحدات فرعية متطابقة مرتبة في دائرة ضيقة. في حالته المغلقة وغير النشطة، تكون هذه الوحدات الفرعية متباعدة بحوالي 15.3 نانومتر. وقد أدت المحاولات السابقة لتصوير هذا الهيكل باستخدام الطرق القياسية إلى ظهور تجمع ضبابي حيث لا يمكن تمييز الوحدات الثلاث. وباستخدام تقنيتهم الجديدة، قام الفريق بوضع علامات على البروتين بستة وسوم مختلفة من DNA وصورها في جولتين فقط، مع توهج ثلاثة أنواع مختلفة من الصبغات في آن واحد في كل جولة. وكشفت الصور الناتية عن الوحدات الفرعية لبروز فيروس HIV-1 بدقة تبلغ حوالي 3 نانومترات.
أظهرت البيانات أن الأجزاء الثلاثة للبروز مرتبة بالفعل في مثلث ضيق، حيث بلغت المسافة بينها حوالي 16 إلى 17 نانومتراً، وهو ما يطابق الهيكل المعروف للفيروس. وكانت هذه هي المرة الأولى التي يتمكن فيها الباحثون من رؤية الوحدات البنائية الفردية لبروتين غلاف HIV-1 بوضوح بينما يتواجد في غشاء خلية حية. ومن خلال إثبات إمكانية استخدام عمر الفلورة لقراءة رموز DNA المتعددة في وقت واحد، يوفر هذا العمل مساراً قابلاً للتوسع لفهم الهندسة المعقدة للبروتينات المعقدة. كما يشير إلى أنه يمكن للعلماء الآن رسم خرائط للترتيب الدقيق للعديد من الأجزاء المختلفة داخل مجمع بروتيني واحد دون قضاء أيام في انتظار الصور المتتالية، مما يفتح الباب لدراسة الآليات الجزيئية للحياة بوضوح وسرعة غير مسبوقين.
غارق في أبحاث مجالك؟
تصلك نشرة يومية بأحدث الأبحاث المطابقة لكلماتك البحثية المفتاحية — مع ملخصات تقنية، بلغتك.