Fluorescence-lifetime encoding for scalable single-protein-resolution imaging
Questo articolo introduce RE-FLIM, una tecnica di codifica del tempo di vita della fluorescenza che supera i limiti di scalabilità quadratica dei metodi precedenti per raggiungere l'imaging a risoluzione di singola proteina, consentendo la visualizzazione di singoli protomeri del trimero di HIV-1 Env in membrane cellulari intatte.
Articolo originale sotto licenza CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Questa è una spiegazione generata dall'IA di un preprint non sottoposto a revisione paritaria. Non è un consiglio medico. Non prendere decisioni sulla salute basandoti su questo contenuto. Leggi il disclaimer completo
Per osservare il meccanismo della vita, gli scienziati si rivolgono spesso a microscopi in grado di scrutare ben oltre i limiti della luce ordinaria. Per decenni, una tecnica chiamata DNA-PAINT ha permesso ai ricercatori di mappare le posizioni di singole proteine con una precisiono di circa 15 nanometri. Questa dimensione è incredibilmente piccola, eppure molti complessi proteici, le unità funzionali che guidano i processi cellulari, sono organizzati su scale ancora più ridotte, spesso distanti tra loro solo di pochi nanometri. Quando questi minuscoli componenti si trovano troppo vicini, i metodi standard di super-risoluzione li confondono in un unico punto indistinto, nascondendo la loro vera struttura. Per risolvere questo problema, gli scienziati hanno sviluppato un metodo chiamato RESI, che agisce come un processo di smistamento lento e meticoloso. Esso etichetta diverse parti di una proteina con tag di DNA unici e poi le riprende un tag alla volta. Aspettando che ogni tag si accenda e si spenga in sequenza, il metodo può individuare il centro di ogni parte con estrema accuratezza. Tuttavia, questo approccio sequenziale presenta un importante collo di bottiglia: man mano che il numero di parti in una proteina aumenta, il tempo necessario per immagini tutte richiede una crescita esplosiva, rendendolo impraticabile per strutture grandi e complesse.
Un team di ricercatori guidato da Sabrina Simoncelli dell'University College London ha ora introdotto un modo più veloce ed efficiente per vedere questi dettagli minuscoli, un metodo che chiamano RE-FLIM. Invece di aspettare per immagini ogni parte della proteina una alla volta, questa nuova tecnica utilizza la "vita media" della luce per distinguere le diverse parti simultaneamente. Ogni molecola di colorante fluorescente brilla per un tempo leggermente diverso dopo essere stata colpita da un laser prima di svanire. Misurando questa durata precisa, il microscopio può distinguere tra diversi tipi di molecole di colorante anche quando stanno brillando contemporaneamente. I ricercatori hanno combinato questa misurazione della vita media con l'elevata precisione di media del vecchio metodo RESI. Ciò ha permesso di risolvere più parti proteiche in un unico scatto, riducendo il numero di cicli di imaging di tre volte rispetto al precedente miglior metodo.
Il team ha testato inizialmente la propria idea su una struttura piatta e rettangolare fatta di DNA, nota come origami di DNA, che fungeva da perfetto righello rigido. Hanno attaccato coppie di filamenti di ancoraggio a questa struttura che erano separati da soli 3,2 nanometri, una distanza troppo piccola per essere risolta dal DNA-PAINT standard. Utilizzando due diversi coloranti fluorescenti che brillavano per lunghezze di tempo differenti, sono stati in grado di vedere entrambi i filamenti chiaramente in un'unica immagine. Il nuovo metodo ha individuato la posizione di ciascun filamento con una precisione di circa 1 nanometro, un miglioramento di otto volte rispetto alla tecnica standard. Hanno ripetuto questo successo con una disposizione triangolare più complessa di tre filamenti, distanziati di circa 5 nanometri l'uno dall'altro. In questo caso, hanno utilizzato tre diversi coloranti simultaneamente. Le immagini risultanti mostravano chiaramente i tre angoli distinti del triangolo, confermando che il metodo poteva gestire più bersagli contemporaneamente senza fonderli tra loro.
Incoraggiati da questi risultati sulle strutture artificiali di DNA, i ricercatori hanno applicato il RE-FLIM a un bersaglio biologico reale: la proteina di involucro dell'HIV-1, una spina che si trova sulla superficie del virus e che aiuta l'infezione delle cellule. Questa proteina esiste come trimero, il che significa che è composta da tre subunità identiche disposte in un cerchio stretto. Nel suo stato chiuso e inattivo, queste subunità sono separate da circa 15,3 nanometri. I tentativi precedenti di immagini questa struttura con i metodi standard hanno prodotto un ammasso sfocato dove le tre subunità non potevano essere distinte. Utilizzando la loro nuova tecnica, il team ha etichettato la proteina con sei diversi tag di DNA e l'ha fotografata in soli due round, con tre diversi tipi di colorante che brillavano contemporaneamente in ogni round. Le immagini risultanti hanno rivelato le singole subunità della spina dell'HIV-1 con una precisiono di circa 3 nanometri.
I dati hanno dimostrato che le tre parti della spina erano effettivamente disposte in un triangolo stretto, con la distanza tra loro che misurava circa 16-17 nanometri, il che corrisponde alla struttura nota del virus. Questa è stata la prima volta che i ricercatori sono stati in grado di vedere chiaramente i singoli blocchi costruttivi della proteina di involucro dell'HIV-1 mentre si trova in una membrana cellulare vivente. Dimostrando che la fluorescenza a tempo di vita può essere utilizzata per leggere più codici a barre di DNA contemporaneamente, questo lavoro offre una via scalabile per comprendere l'intricata architettura di proteine complesse. Suggerisce che gli scienziati possono ora mappare la disposizione precisa di molte parti diverse all'interno di un singolo complesso proteico senza passare giorni ad aspettare immagini sequenziali, aprendo la porta allo studio del meccanismo molecolare della vita con una chiarezza e una velocità senza precedenti.
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