Fluorescence-lifetime encoding for scalable single-protein-resolution imaging
Cet article présente la RE-FLIM, une technique de codage par temps de vie de fluorescence qui surmonte les limitations de mise à l'échelle quadratique des méthodes précédentes pour atteindre une imagerie à la résolution d'une protéine unique, permettant la visualisation de protomères individuels du trimère Env du VIH-1 dans les membranes cellulaires intactes.
Article original sous licence CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Ceci est une explication générée par l'IA d'un preprint qui n'a pas été évalué par des pairs. Ce n'est pas un avis médical. Ne prenez pas de décisions de santé basées sur ce contenu. Lire la clause de non-responsabilité complète
Pour observer la machinerie de la vie, les scientifiques se tournent souvent vers des microscopes capables de scruter bien au-delà des limites de la lumière ordinaire. Pendant des décennies, une technique appelée DNA-PAINT a permis aux chercheurs de cartographier les positions de protéines individuelles avec une précision d'environ 15 nanomètres. C'est incroyablement petit, pourtant de nombreux complexes protéiques, les unités fonctionnelles qui pilotent les processus cellulaires, sont organisés à des échelles encore plus réduites, souvent espacés de seulement quelques nanomètres. Lorsque ces composants minuscules sont trop proches les uns des autres, les méthodes de super-résolution standard les floutent en un seul point indistinct, cachant leur véritable structure. Pour résoudre ce problème, les scientifiques ont développé une méthode appelée RESI, qui agit comme un processus de tri lent et méticuleux. Elle marque différentes parties d'une protéine avec des étiquettes d'ADN uniques, puis les imagerie une étiquette à la fois. En attendant que chaque étiquette clignote et s'éteigne en séquence, la méthode peut localiser le centre de chaque partie avec une extrême précision. Cependant, cette approche séquentielle présente un goulot d'étranglement majeur : à mesure que le nombre de parties dans une protéine augmente, le temps nécessaire pour toutes les imager croît de manière explosive, ce qui la rend peu pratique pour les structures larges et complexes.
Une équipe de chercheurs dirigée par Sabrina Simoncelli à l'University College London a maintenant introduit une façon plus rapide et plus efficace de voir ces détails minuscules, une méthode qu'ils appellent RE-FLIM. Au lieu d'attendre pour imager chaque partie de la protéine une par une, cette nouvelle technique utilise la « durée de vie » de la lumière pour distinguer les différentes parties simultanément. Chaque molécule de colorant fluorescent brille pendant une durée légèrement différente après avoir été frappée par un laser avant de s'estomper. En mesurant cette durée précise, le microscope peut distinguer différents types de molécules de colorant même lorsqu'elles brillent en même temps. Les chercheurs ont combiné cette mesure de durée de vie avec la moyenne de haute précision de l'ancienne méthode RESI. Cela leur a permis de résoudre plusieurs parties de protéines en une seule prise, réduisant le nombre de cycles d'imagerie par trois par rapport à la meilleure méthode précédente.
L'équipe a d'abord testé son idée sur une structure rectangulaire plate faite d'ADN, connue sous le nom d'origami d'ADN, qui servait de règle rigide parfaite. Ils ont attaché des brins d'ancrage à cette structure qui étaient séparés de seulement 3,2 nanomètres, une distance trop petite pour être résolue par le DNA-PAINT standard. En utilisant deux colorants fluorescents différents qui brillaient pendant des durées différentes, ils ont pu voir les deux brins clairement en une seule image. La nouvelle méthode a localisé l'emplacement de chaque brin avec une précision d'environ 1 nanomètre, une amélioration de huit fois par rapport à la technique standard. Ils ont répété ce succès avec un arrangement triangulaire plus complexe de trois brins, espacés d'environ 5 nanomètres. Dans ce cas, ils ont utilisé trois colorants différents simultanément. Les images résultantes ont clairement montré les trois coins distincts du triangle, confirmant que la méthode pouvait gérer plusieurs cibles à la fois sans les confondre.
Encouragés par ces résultats sur les structures d'ADN artificielles, les chercheurs ont appliqué la RE-FLIM à une cible biologique réelle : la protéine d'enveloppe du VIH-1, une pointe qui se trouve à la surface du virus et l'aide à infecter les cellules. Cette protéine existe sous forme de trimère, ce qui signifie qu'elle est composée de trois sous-unités identiques disposées en un cercle serré. Dans son état fermé et inactif, ces sous-unités sont séparées d'environ 15,3 nanomètres. Les tentatives précédentes d'imagerie de cette structure avec les méthodes standard résultaient en un amas flou où les trois sous-unités ne pouvaient pas être distinguées. En utilisant leur nouvelle technique, l'équipe a marqué la protéine avec six étiquettes d'ADN différentes et les a imagées en seulement deux cycles, avec trois types de colorants différents brillant simultanément dans chaque cycle. Les images résultantes ont révélé les sous-unités individuelles de la pointe du VIH-1 avec une précision d'environ 3 nanomètres.
Les données ont montré que les trois parties de la pointe étaient effectivement disposées en un triangle serré, avec une distance entre elles mesurant environ 16 à 17 nanomètres, ce qui correspond à la structure connue du virus. C'est la première fois que des chercheurs ont pu voir clairement les blocs de construction individuels de la protéine d'enveloppe du VIH-1 alors qu'elle se trouve dans la membrane d'une cellule vivante. En prouvant que la durée de vie de la fluorescence peut être utilisée pour lire plusieurs codes-barres d'ADN en même temps, ce travail offre une voie évolutive pour comprendre l'architecture complexe des protéines. Cela suggère que les scientifiques peuvent désormais cartographier l'arrangement précis de nombreuses parties différentes au sein d'un seul complexe protéique sans passer des jours à attendre des images séquentielles, ouvrant la porte à l'étude de la machinerie moléculaire de la vie avec une clarté et une rapidité sans précédent.
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