Fluorescence-lifetime encoding for scalable single-protein-resolution imaging
Diese Arbeit stellt RE-FLIM vor, eine Technik zur Kodierung der Fluoreszenzlebensdauer, welche die quadratischen Skalierungsbeschränkungen früherer Methoden überwindet, um eine Bildgebung mit Einzelproteinauflösung zu erreichen und so die Visualisierung einzelner HIV-1-Env-Trimer-Protomer in intakten Zellmembranen zu ermöglichen.
Originalarbeit lizenziert unter CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dies ist eine KI-generierte Erklärung eines Preprints, das nicht peer-reviewed wurde. Dies ist kein medizinischer Rat. Treffen Sie keine Gesundheitsentscheidungen auf Grundlage dieses Inhalts. Vollständigen Haftungsausschluss lesen
Um die Maschinerie des Lebens zu sehen, wenden sich Wissenschaftler oft Mikroskopen zu, die weit über die Grenzen des gewöhnlichen Lichts hinausblicken können. Jahrzehntelang ermöglichte eine Technik namens DNA-PAINT es Forschern, die Positionen einzelner Proteine mit einer Präzision von etwa 15 Nanometern abzubilden. Das ist unglaublich klein, doch viele Proteinkomplexe – die funktionellen Einheiten, die zelluläre Prozesse vorantreiben – sind auf Skalen organisiert, die noch kleiner sind, oft nur wenige Nanometer voneinander entfernt. Wenn diese winzigen Komponenten zu nah beieinander liegen, lassen sie herkömmliche Super-Resolution-Methoden zu einem einzigen, undeutlichen Fleck verschwimmen und verbergen so ihre wahre Struktur. Um dies zu lösen, entwickelten Wissenschaftler eine Methode namens RESI, die wie ein langsamer, sorgfältiger Sortierprozess wirkt. Sie markiert verschiedene Teile eines Proteins mit einzigartigen DNA-Tags und bildet diese dann nacheinander ab. Indem man darauf wartet, dass jeder Tag nacheinander aufblinkt und wieder erlischt, kann die Methode das Zentrum jedes Teils mit extremer Genauigkeit bestimmen. Dieser sequentielle Ansatz hat jedoch einen großen Engpass: Mit zunehmender Anzahl der Teile eines Proteins steigt die benötigte Zeit für die Bildgebung explosionsartig an, was ihn für große, komplexe Strukturen unpraktisch macht.
Ein Team von Forschern unter der Leitung von Sabrina Simoncelli am University College London hat nun eine schnellere, effizientere Art eingeführt, diese winzigen Details zu sehen – eine Methode, die sie RE-FLIM nennen. Anstatt darauf zu warten, jedes Proteinteil einzeln abzubilden, nutzt diese neue Technik die „Lebensdauer“ des Lichts, um verschiedene Teile gleichzeitig voneinander zu unterscheiden. Jedes fluoreszierende Farbstoffmolekül leuchtet für eine leicht unterschiedliche Zeitspanne nach, nachdem es von einem Laser getroffen wurde, bevor es verblasst. Durch Messung dieser präzisen Dauer kann das Mikroskop zwischen verschiedenen Arten von Farbstoffmolekülen unterscheiden, selbst wenn sie gleichzeitig leuchten. Die Forscher kombinierten diese Lebensdauer-Messung mit der hochpräzisen Mittelung der älteren RESI-Methode. Dies ermöglichte es, mehrere Proteinteile in einem einzigen Durchgang aufzulösen, wodurch die Anzahl der benötigten Bildgebungsrunden im Vergleich zur bisher besten Methode um das Dreifache reduziert wurde.
Das Team testete seine Idee zuerst an einer flachen, rechteckigen Struktur aus DNA, bekannt als DNA-Origami, die als perfektes, starres Lineal diente. Sie befestigten Paare von Docking-Strängen an diese Struktur, die nur 3,2 Nanometer voneinander entfernt waren – eine Distanz, die zu gering ist, um sie mit Standard-DNA-PAINT aufzulösen. Durch die Verwendung von zwei verschiedenen fluoreszierenden Farbstoffen, die unterschiedlich lange leuchten, konnten sie beide Stränge deutlich in einem einzigen Bild sehen. Die neue Methode bestimmte den Ort jedes Strangs mit einer Präzision von etwa 1 Nanometer, was eine achtmalige Verbesserung gegenüber der Standardtechnik darstellt. Sie wiederholten diesen Erfolg mit einer komplexeren, dreieckigen Anordnung von drei Strängen, die etwa 5 Nanometer voneinander entfernt waren. In diesem Fall verwendeten sie drei verschiedene Farbstoffe gleichzeitig. Die resultierenden Bilder zeigten die drei deutlichen Ecken des Dreiecks klar und bestätigten, dass die Methode mehrere Ziele gleichzeitig verarbeiten kann, ohne sie miteinander zu verschmelzen.
Ermutigt durch diese Ergebnisse an den künstlichen DNA-Strukturen, wandten die Forscher RE-FLIM auf ein echtes biologisches Ziel an: das HIV-1-Hüllprotein, einen Spike, der auf der Oberfläche des Virus sitzt und ihm hilft, Zellen zu infizieren. Dieses Protein existiert als Trimer, was bedeutet, dass es aus drei identischen Untereinheiten besteht, die in einem engen Kreis angeordnet sind. In seinem geschlossenen, inaktiven Zustand sind diese Untereinheiten etwa 15,3 Nanometer voneinander entfernt. Frühere Versuche, diese Struktur mit Standardmethoden abzubilden, ergaben einen verschwommenen Klumpen, in dem die drei Untereinheiten nicht unterschieden werden konnten. Mit ihrer neuen Technik markierte das Team das Protein mit sechs verschiedenen DNA-Tags und bildete sie in nur zwei Runden ab, wobei in jeder Runde drei verschiedene Farbstofftypen gleichzeitig leuchteten. Die resultierenden Bilder enthüllten die einzelnen Untereinheiten des HIV-1-Spikes mit einer Präzision von etwa 3 Nanometern.
Die Daten zeigten, dass die drei Teile des Spikes tatsächlich in einem engen Dreieck angeordnet waren, wobei der Abstand zwischen ihnen etwa 16 bis 17 Nanometer betrug, was der bekannten Struktur des Virus entspricht. Dies war das erste Mal, dass Forscher in der Lage waren, die einzelnen Bausteine des HIV-1-Hüllproteins klar zu sehen, während es in einer lebenden Zellmembran sitzt. Indem sie bewiesen haben, dass Fluoreszenz-Lebensdauer verwendet werden kann, um mehrere DNA-Barcodes gleichzeitig zu lesen, bietet diese Arbeit einen skalierbaren Weg zum Verständnis der komplizierten Architektur komplexer Proteine. Sie legt nahe, dass Wissenschaftler nun die präzise Anordnung vieler verschiedener Teile innerhalb eines einzelnen Proteinkomplexes kartieren können, ohne Tage auf sequentielle Bilder warten zu müssen, was die Tür zur Untersuchung der molekularen Maschinerie des Lebens mit beispielloser Klarheit und Geschwindigkeit öffnet.
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