Fluorescence-lifetime encoding for scalable single-protein-resolution imaging
Dit artikel introduceert RE-FLIM, een techniek voor fluorescentie-levensduurcodering die de kwadratische schaleringsbeperkingen van eerdere methoden overwint om beeldvorming met resolutie op enkelvoudig eiwitniveau te bereiken, wat de visualisatie van individuele HIV-1 Env-trimeerprotomeren in intacte celmembranen mogelijk maakt.
Oorspronkelijk artikel gelicentieerd onder CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dit is een AI-gegenereerde uitleg van een preprint die niet peer-reviewed is. Dit is geen medisch advies. Neem geen gezondheidsbeslissingen op basis van deze inhoud. Lees de volledige disclaimer
Om de machinerie van het leven te zien, wenden wetenschappers zich vaak tot microscopen die ver voorbij de grenzen van gewoon licht kunnen kijken. Decennialang heeft een techniek genaamd DNA-PAINT onderzoekers in staat gesteld om de posities van individuele eiwitten in kaart te brengen met een precisie van ongeveer 15 nanometer. Dit is ongelooflijk klein, maar veel eiwitcomplexen, de functionele eenheden die cellulaire processen aansturen, zijn georganiseerd op schalen die nog kleiner zijn, vaak slechts enkele nanometers uit elkaar. Wanneer deze minuscule componenten te dicht bij elkaar zitten, vervagen standaard superresolutie-methoden ze tot één onduidelijke vlek, waardoor hun ware structuur verborgen blijft. Om dit op te lossen, ontwikkelden wetenschappers een methode genaamd RESI, die werkt als een traag, zorgvuldig sorteerproces. Het labelt verschillende delen van een eiwit met unieke DNA-tags en beeldt deze vervolgens één voor één af. Door te wachten tot elke tag in een specifieke volgorde aan- en uitflitst, kan de methode het centrum van elk deel met extreme nauwkeurigheid vaststellen. Deze sequentiële aanpak heeft echter een grote flessenhals: naarmate het aantal onderdelen in een eiwit toeneemt, groeit de tijd die nodig is om ze allemaal te beeldvormen explosief, wat het onpraktisch maakt voor grote, complexe structuren.
Een team van onderzoekers onder leiding van Sabrina Simoncelli aan University College London heeft nu een snellere, efficiëntere manier geïntroduceerd om deze kleine details te zien, een methode die zij RE-FLIM noemen. In plaats van te wachten om elk eiwitdeel één voor één te beeldvormen, gebruikt deze nieuwe techniek de "levensduur" van licht om verschillende delen tegelijkertijd van elkaar te onderscheiden. Elk fluorescerend kleurstofmolecuul gloeit een iets andere tijd na te worden geraakt door een laser voordat het vervaagt. Door deze exacte duur te meten, kan de microscoop verschillende soorten kleurstofmoleculen onderscheiden, zelfs wanneer ze tegelijkertijd oplichten. De onderzoekers combineerden deze levensduurmeting met de hoogprecisie-gemiddelden van de oudere RESI-methode. Dit stelde hen in staat om meerdere eiwitdelen in één enkele opname te onderscheiden, waardoor het aantal beeldvormingsrondes met drie keer werd verminderd ten opzien van de vorige beste methode.
Het team testte hun idee eerst op een platte, rechthoekige structuur gemaakt van DNA, een zogenaamde DNA-origami, die diende als een perfecte, rigide liniaal. Ze bevestigden paren docking-strengen aan deze structuur die slechts 3,2 nanometer van elkaar gescheiden waren, een afstand die te klein is voor standaard DNA-PAINT om te onderscheiden. Door twee verschillende fluorescerende kleurstoffen te gebruiken die verschillende tijdsduur gloeiden, waren ze in staat om beide strengen duidelijk te zien in één enkel beeld. De nieuwe methode bepaalde de locatie van elke streng met een precisie van ongeveer 1 nanometer, een achtmaal verbetering ten opzien van de standaardtechniek. Ze herhaalden dit succes met een complexere driehoekige opstelling van drie strengen, die ongeveer 5 nanometer uit elkaar liggen. In dit geval gebruikten ze drie verschillende kleurstoffen tegelijkertijd. De resulterende beelden toonden duidelijk de drie afzonderlijke hoeken van de driehoek, wat bevestigde dat de methode meerdere doelwitten tegelijkertijd kan verwerken zonder ze met elkaar te laten versmelten.
Gestimuleerd door deze resultaten op de kunstmatige DNA-structuren, pasten de onderzoekers RE-FLIM toe op een echt biologisch doelwit: het HIV-1-envelop eiwit, een spike die op het oppervlak van het virus zit en het helpt cellen te infecteren. Dit eiwit bestaat als een trimeer, wat betekent dat het is opgebouwd uit drie identieke subeenheden die in een nauwe cirkel zijn gerangschikt. In zijn gesloten, inactieve staat zijn deze subeenheden gescheiden door ongeveer 15,3 nanometer. Eerdere pogingen om deze structuur met standaardmethoden in beeld te brengen, resulteerden in een wazige cluster waar de drie subeenheden niet van elkaar te onderscheiden waren. Met hun nieuwe techniek labelden de onderzoekers het eiwit met zes verschillende DNA-tags en beeldden ze deze af in slechts twee rondes, waarbij in elke ronde drie verschillende typen kleurstoffen tegelijkertijd gloeiden. De resulterende beelden onthulden de individuele subeenheden van de HIV-1-spike met een precisie van ongeveer 3 nanometer.
De gegevens toonden aan dat de drie delen van de spike inderdaad in een nauwe driehoek waren gerangschikt, waarbij de afstand tussen hen ongeveer 16 tot 17 nanometer bedroeg, wat overeenkomt met de bekende structuur van het virus. Dit was de eerste keer dat onderzoekers in staat waren om de individuele bouwstenen van het HIV-1-envelop eiwit duidelijk te zien terwijl het zich in een levend celmembraan bevindt. Door te bewijzen dat fluorescentie-levensduur kan worden gebruikt om meerdere DNA-barcodes tegelijkertijd te lezen, biedt dit werk een schaalbaar pad naar het begrijpen van de ingewikkelde architectuur van complexe eiwitten. Het suggereert dat wetenschappers nu de precieze rangschikking van vele verschillende onderdelen binnen een enkel eiwitcomplex in kaart kunnen brengen zonder dagen te hoeven wachten op sequentiële beelden, wat de deur opent naar het bestuderen van de moleculaire machinerie van het leven met ongekende helderheid en snelheid.
Verdrinkt u in papers in uw vakgebied?
Ontvang dagelijkse digests van de nieuwste papers die bij uw onderzoekswoorden passen — met technische samenvattingen, in uw taal.