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Fluorescence-lifetime encoding for scalable single-protein-resolution imaging

本文介绍了一种名为 RE-FLIM 的荧光寿命编码技术，该技术克服了以往方法的二次方缩放限制，实现了单蛋白质分辨率成像，从而能够对完整细胞膜中的单个 HIV-1 Env 三聚体原聚体进行可视化。

原作者： Sabrina Simoncelli, Alessia Gentili, Robert Hollmann, Cecilia Zaza, Harry Holmes, Karol Kołątaj, David Williamson, Irene Carlon-Andres, Tomas Malinauskas, Guillermo Acuna, Sergi Padilla Parra

发布于 2026-09-02

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CC BY 4.0

原作者： Sabrina Simoncelli, Alessia Gentili, Robert Hollmann, Cecilia Zaza, Harry Holmes, Karol Kołątaj, David Williamson, Irene Carlon-Andres, Tomas Malinauskas, Guillermo Acuna, Sergi Padilla Parra

原始论文采用 CC BY 4.0 许可（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。 ⚕️ 这是一篇未经同行评审的预印本的AI生成解释。这不是医疗建议。请勿根据此内容做出健康决定。阅读完整免责声明

为了观察生命的机制，科学家们经常转向那些能够洞察远超普通光线极限的显微镜。几十年来，一种被称为 DNA-PAINT 的技术一直允许研究人员以约 15 纳米的精度绘制单个蛋白质的位置。这已经极其微小，然而许多蛋白质复合物（驱动细胞过程的功能单元）的组织规模甚至更小，通常仅相距几纳米。当这些微小的组件靠得太近时，标准的超分辨率方法会将它们模糊成一个单一且不清晰的点，从而掩盖了它们的真实结构。为了解决这个问题，科学家开发了一种名为 RESI 的方法，它就像一个缓慢而细致的分类过程。该方法用独特的 DNA 标签标记蛋白质的不同部分，然后逐个对每个标签进行成像。通过等待每个标签按顺序闪烁开启和关闭，该方法可以极高精度地定位每个部分的中心。然而，这种顺序处理方式存在一个主要的瓶颈：随着蛋白质部件数量的增加，成像所需的时间会呈爆炸式增长，使得对大型复杂结构的成像变得不切实际。

由伦敦大学学院的 Sabrina Simoncelli 领导的一个研究小组现在推出了一种更快、更高效的方法来观察这些微小细节，他们称之为 RE-FLIM。RE-FLIM 不再等待逐一成像每个蛋白质部分，而是利用光的“寿命”来同时区分不同的部分。每种荧光染料分子在受到激光照射后，在褪去之前都会发光一段略微不同的时间。通过测量这一精确的持续时间，显微镜即使在不同染料分子同时发光时，也能区分出不同类型的染料分子。研究人员将这种寿命测量法与旧有 RESI 方法的高精度平均法相结合。这使得他们能够在单次拍摄中解析出多个蛋白质部分，与之前的最佳方法相比，将所需的成像轮数减少了三倍。

团队首先在一种由 DNA 制成的扁平矩形结构（称为 DNA 折纸，DNA origami）上测试了他们的想法，这种结构充当了一个完美的刚性标尺。他们在该结构上附着了成对的对接链，这些链之间的距离仅为 3.2 纳米，这一距离对于标准的 DNA-PAINT 来说太小，无法分辨。通过使用两种发光时长不同的荧光染料，他们能够在单张图像中清晰地看到这两条链。新方法定位每条链的位置精度约为 1 纳米，比标准技术提高了八倍。他们随后在一个更复杂的、由三条链组成的三角形排列（间距约为 5 纳米）上重复了这一成功。在这种情况下，他们同时使用了三种不同的染料。生成的图像清晰地显示了三角形的三个顶点，证实了该方法可以处理多个目标而不会将它们模糊在一起。

在这些人工 DNA 结构取得成功后，研究人员将 RE-FLIM 应用于一个真实的生物靶点：HIV-1 包膜蛋白，这是位于病毒表面并帮助其感染细胞的“刺突”。这种蛋白质以三聚体形式存在，这意味着它由三个相同的亚基组成，排列成一个紧密的圆圈。在其关闭的失活状态下，这些亚基之间的距离约为 15.3 纳米。以往尝试用标准方法对该结构成像的结果是一个模糊的簇，导致三个亚基无法被区分。使用他们的新技术，团队用六个不同的 DNA 标签标记了该蛋白质，并在仅两次成像轮次中完成了成像，每轮中有三种不同类型的染料同时发光。生成的图像以约 3 纳米的精度揭示了 HIV-1 刺突的各个亚基。

数据表明，刺突的三个部分确实排列成一个紧密的三角形，它们之间的距离约为 16 到 17 纳米，这与病毒的已知结构相吻合。这是研究人员首次能够在活细胞膜中清晰地观察到 HIV-1 包膜蛋白的单个构建模块。通过证明荧光寿命可以用于同时读取多个 DNA 条形码，这项工作为理解复杂蛋白质的精细架构提供了一条可扩展的路径。它表明，科学家现在可以绘制单个蛋白质复合物内许多不同部分的精确排列，而无需花费数天时间等待顺序成像，从而为以空前的清晰度和速度研究生命分子机制打开了大门。

技术摘要：用于可扩展单蛋白分辨率成像的荧光寿命编码技术

问题陈述
解析蛋白质复合物内的单个亚基需要超越标准 DNA-PAINT 单分子定位显微术（SMLM）约 15 nm 极限的空间精度。虽然通过正交 DNA 条形码进行定位平均实现的分辨率增强型顺序成像（RESI）可以达到亚纳米级的精度，但它面临着可扩展性的瓶颈。随着复合物中亚基数量 ( $m$ ) 的增加，所需的正交序列数量 ( $N$ ) 必须呈二次方增长（ $N \propto m(m-1)$ ）以确保唯一分配。由于 RESI 每轮仅成像一种序列，采集时间随亚基数量呈二次方增长，这限制了其在大型复合物中的应用。

方法论：RE-FLIM
作者引入了分辨率增强型荧光寿命成像显微术（RE-FLIM），该方法将荧光寿命分离与 RESI 的定位平均原理相结合。

原理： RE-FLIM 不再每轮成像一种条形码，而是利用荧光寿命作为正交编码轴。这使得在单次采集轮次中同时区分多个不同的 DNA 条形码成为可能。
实现： 该系统采用宽场时间相关单光子计数（TCSPC）相机（LINCam）来记录光子到达时间。通过使用具有不同寿命（例如 Cy3B、Atto 550、Alexa Fluor 555）的荧光基团标记的成像链，该方法根据测得的荧光寿命将结合事件分配给特定的物种。
工作流程：
1. 成像： 对 DNA 折纸或生物样本进行包含多个正交对接链的成像。
2. 事件识别： 通过将连续帧中的定位进行关联，并利用变点检测优化光子强度轨迹的边界来识别结合事件。
3. 物种分配： 为每个事件估计荧光寿命。如果事件的寿命落在相对于参考值的特定不确定范围内，则将其分配给特定的成像物种。
4. 簇重建： 将分配到同一物种的定位进行聚类（类似于 RESI），并计算每个簇的质心以实现增强的精度（ $\sigma_{RE-FLIM}$ ）。

关键结果

DNA 折纸验证（2 物种）：
- 该方法在包含两对间隔 3.2 nm 的正交对接链的 DNA 折纸结构上进行了验证。
- 标准 DNA-PAINT 实现的定位精度（ $\sigma_{SMLM}$ ）约为 8 nm，无法解析 3.2 nm 的间距。
- RE-FLIM 实现了约 1 nm 的精度，成功解析了这两个位点。
- 基于寿命的分配正确分类了 92% 的结合事件。第一最近邻距离（NND）分析恢复了预期的 3.2 nm 间距（实测为 3.5 nm）。
DNA 折纸验证（3 物种）：
- 该方法被扩展到同时成像排列在约 5.0 × 5.6 × 5.6 nm 三角形中的三个正交条形码。
- 三种寿命不同的成像物种在单轮成像中被解析，分配准确度为 92%。
- RE-FLIM 保留了结构准确性，恢复了具有 6.0 nm 和 7.7 nm NND 峰值的三角形几何结构，这与三轮 RESI 的测量结果一致，但仅需三分之一的成像轮次。
在 HIV-1 Env 三聚体中的应用：
- RE-FLIM 被应用于在 U2OS 细胞中表达的 HXB2 HIV-1 包膜糖蛋白（Env）三聚体。这些三聚体以约 50% 的效率被随机标记了六种正交纳米抗体-DNA 条形码。
- 两轮 RE-FLIM（每轮解析三种物种）生成了六种条形码群体。
- 分辨率： RE-FLIM 解析单个 Env 原聚体的精度约为 3 nm（ $\sigma_{RE-FLIM}$ ），而 DNA-PAINT（ $\sigma_{SMLM} \approx 11$ nm）无法区分 15.3 nm 三聚体内的原聚体。
- 结构分析： 基于图的聚类识别了三聚体、类二聚体和类单体构型。分类后的三聚体内两两边长中位数为 16.3 nm，众数为 17.2 nm，与预测的闭合态 Env 三聚体 15.3 nm 间距一致。
- 该方法揭示了 Env 原聚体在质膜上的短程纳米级组织，能够区分内在聚集与完全空间随机性（CSR）。

意义与主张
论文声称，RE-FLIM 为实现原生蛋白质复合物的原聚体级成像提供了一条可扩展的途径。通过同时解析多个条形码，与针对三物种系统的 RESI 相比，它将所需的成像轮数减少了三倍，从而缓解了顺序成像的组合时间限制。

据作者所知，这项工作展示了第一个在完整细胞膜内观察到的 HIV-1 Env 三聚体的原聚体级视图。该方法无需额外的激光线或光谱通道，而是依赖于荧光发射的时间维度即可实现。结果表明，RE-FLIM 可以在保持结构准确性的同时，解析远低于 DNA-PAINT 分辨率极限的间距（在折纸上约为 3 nm，在生物复合物上约为 15 nm）。

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