Fluorescence-lifetime encoding for scalable single-protein-resolution imaging
本論文は、従来のメソッドにおける二次関数的なスケーリングの限界を克服し、単一タンパク質分解能でのイメージングを実現することで、無傷の細胞膜内における個々のHIV-1 Env三量体プロトマーの可視化を可能にする蛍光寿命エンコーディング技術、RE-FLIMを紹介するものである。
原論文は CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) でライセンスされています。 これは査読を受けていないプレプリントのAI生成解説です。医学的助言ではありません。この内容に基づいて健康上の判断をしないでください。 免責事項の全文を読む
生命の仕組みを見るために、科学者たちはしばしば、普通の光の限界をはるかに超えて覗き込むことができる顕微鏡を利用します。数十年にわたり、DNA-PAINTと呼ばれる技術によって、研究者は個々のタンパク質の位置を約15ナノメートルの精度でマッピングしてきました。これは驚くほど小さな数値ですが、細胞内のプロセスを駆動する機能単位である多くのタンパク質複合体は、それよりもさらに小さなスケール、しばしばわずか数ナノメートルという間隔で構成されています。これらの極小の構成要素が近すぎると、標準的な超解像法ではそれらが一つの不明瞭な点へとぼやけてしまい、その真の構造を隠してしまいます。これを解決するために、科学者たちはRESIと呼ばれる、ゆっくりとした丁寧な仕分け作業のような手法を開発しました。これは、タンパク質の異なる部分にそれぞれ固有のDNAタグをラベル付けし、それらを一つずつ順番に撮影するものです。各タグが順番に点滅するのを待つことで、この手法は各部分の中心を極めて正確に特定することができます。しかし、この逐次的なアプローチには大きなボトルネックがあります。タンパク質のパーツの数が増えるにつれて、それらすべてを撮影するために必要な時間が爆発的に増加するため、大きく複雑な構造に対しては実用的ではないのです。
ユニバーシティ・カレッジ・ロンドンのサブリナ・シモンチェッリ率いる研究チームは、こうした微細な詳細をより速く、より効率的に見るための新しい方法、彼らがRE-FLIMと呼ぶ手法を導入しました。タンパク質の各パーツを一つずつ順番に撮影するのを待つ代わりに、この新しい技術は、光の「寿命」を利用して異なるパーツを同時に識別します。すべての蛍光色素分子は、レーザーに当たった後、消えるまでにそれぞれわずかに異なる時間、光り続けます。この正確な持続時間を測定することで、顕微鏡は異なる種類の色素分子が同時に光っている場合でも、それらを区別することができます。研究者たちは、この寿命測定を従来のRESI法による高精度な平均化法と組み合わせました。これにより、タンパク質の複数のパーツを一度の撮影で解像することが可能になり、従来の最良の手法と比較して、必要な撮影回数を3分の1に削減できました。
チームはまず、このアイデアを、完璧で硬い定規として機能する「DNAオリガミ」として知られる、DNAで作られた平坦な長方形の構造体でテストしました。彼らはこの構造体に、わずか3.2ナノメートルの間隔で離れた一対のドッキング鎖を取り付けました。この距離は、標準的なDNA-PAINTでは解像できない距離です。異なる長さの時間光る2種類の蛍光色素を使用することで、彼らは単一の画像内で両方の鎖を明確に捉えることができました。この新手法は、各鎖の位置を約1ナノメートルの精度で特定し、これは標準的な手法に対して8倍の向上となります。彼らはこの成功を、約5ナノメートルの間隔で配置された3本の鎖からなる、より複雑な三角形の配置を用いて繰り返しました。このケースでは、3種類の異なる色素を同時に使用しました。得られた画像は、3つの角を明確に示しており、この手法が複数のターゲットを同時に処理しても、それらが混ざり合ってぼやけることがないことを証明しました。
これらの人工的なDNA構造体による結果に勇気づけられ、研究者たちはRE-FLIMを実際の生物学的標的、すなわちHIV-1エンベロープタンパク質に適用しました。これはウイルスの表面に存在するスパイクであり、細胞への感染を助けるものです。このタンパク質は三量体として存在し、つまり3つの同一のサブユニットが狭い円形に配置されています。閉じた不活性状態において、これらのサブユニットは約15.3ナノメートルの間隔で離れています。標準的な手法を用いたこれまでの試みでは、3つのサブユニットを区別できない、ぼやけたクラスターとなっていました。彼らの新技術を用い、チームはタンパク質に6種類の異なるDNAタグをラベル付けし、3種類の異なる色素が各ラウンドで同時に光る形で、わずか2回のラウンドで撮影を行いました。得られた画像は、HIV-1スパイクの個々のサブユニットを約3ナノメートルの精度で明らかにしました。
データは、スパイクの3つの部分が確かに狭い三角形に配置されていることを示しており、それらの間の距離は約16から17ナノメートルと測定され、これは既知のウイルスの構造と一致しています。これは、研究者が生存している細胞膜の中で、HIV-1エンベロープタンパク質の個々の構成要素を明確に観察できた初めての事例となりました。蛍光寿命を用いることで複数のDNAバーコードを同時に読み取れることを証明したこの研究は、複雑なタンパク質の精緻な構造を理解するためのスケーラブルな道筋を提示しています。これは、科学者が逐次的な画像を待つために何日も費やすことなく、単一のタンパク質複合体内の多くの異なる部分の精密な配置をマッピングできることを示唆しており、前例のない明快さとスピードで生命の分子メカニズムを研究する扉を開くものです。
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