Single-Shot Replica-Free Common-Path Quantitative Phase Imaging with Doubled Field of View

لرؤية العالم غير المرئي للخلايا الحية دون صبغها بالأصباغ أو قتلها، يعتمد العلماء على تقنية تسمى التصوير الطوري الكمي. وبدلاً من النظر إلى كيفية امتصاص العينة للضوء، تقيس هذه الطريقة كيفية إبطاء العينة للضوء أثناء مروره عبرها. ولأن الخلايا الحية شفافة في الغالب، فهي لا تحجب الضوء، لكنها تؤخره قليلاً اعتماداً على سمكها وكثافتها. ومن خلال قياس هذا التأخير الضئيل، يمكن للباحثين إنشاء خريطة مفصلة لبنية الخلية، بل وحتى حساب كتلتها الجافة. ويعد استخدام نظام حيث يسلك شعاع الضوء مساراً واحداً مشتركاً أحد أكثر الطرق استقراراً، مما يجعل النظام مقاوماً للاهتزازات والتغيرات الحرارية التي عادة ما تفسد القياسات الدقيقة. ومع ذلك، فإن هذا الاستقرار يأتي مع مقايضة محبطة: فالطريقة القياسية تخلق صورة "شبحية"، وهي نسخة مكررة من العينة تتداخل مع الأصلية. ولتجنب هذا الارتباك، اضطر العلماء تقليدياً إلى النظر فقط في العينات المتفرقة حيث لا يلمس الشبح الكائن الحقيقي، مما يعني التخلي فعلياً عن أكثر من نصف مساحة الرؤية للكاميرا وجعل من المستحيل دراسة التجمعات الكثيفة من الخلايا.

لقد وجد فريق من الباحثين في جامعة وارسو للتكنولوجيا ومعهد نينتسكي لبيولوجيا التجريب طريقة لكسر هذا القيد. فقد طوروا طريقة جديدة تزيل الصورة الشبحية تماماً، مما يسمح لهم برؤية مجال الرؤية الكامل في لحظة واحدة، حتى عندما تكون العينة مزدحمة بالخلايا. إن نهجهم، الموصوف في عملهم الأخير، يستبدل الأجزاء الميكانيكية المتحركة في الأنظمة القديمة باستخدام ذكي للون الضوء. فمن خلال تغيير لون مصدر الضوء، يمكنهم تغيير موضع الصورة الشبحية دون تحريك أي عدسات أو مرايا. ثم يستخدمون خوارزمية حاسوبية متطورة لفصل الصورة الحقيقية عن الشبح رياضياً، مما يؤدي فعلياً إلى مضاعفة المساحة القابلة للاستخدام في مستشعر الكاميرا. وهذا يسمح بالتصوير عالي السرعة والواضح للعينات البيولوجية الكثفة والمتحركة، مثل مستنبتات الخميرة والشبكات العصبية، والتي كانت في السابق مزدحمة للغاية بحيث يصعب دراستها بهذا المستوى من الوضوح.

يكمن جوهر المشكلة التي حلها الفريق في كيفية عمل هذه المجاهر. في الإعداد ذي المسار المشترك، يتداخل الضوء الذي يمر عبر العينة مع نسخة من نفسه تم إزاحتها قليلاً إلى الجانب. ويخلق هذا التداخل نمطاً يحمل المعلومات اللازمة لإعادة بناء الصورة. ولكن نظرًا لأن النسخة مزاحة، فإنها غالباً ما تقع فوق العينة الأصلية مباشرة في الصورة النهائية. إذا كانت العينة متفرقة، مع وجود مساحات فارغة كبيرة بين الخلايا، فإن النسخة ستقع في المنطقة الفارغة ولن تسبب أي مشكلة. أما إذا كانت العينة كثيفة، مثل طبق بتري مزدحم بالخميرة، فإن النسخة تتداخل مع الخلايا الحقيقية، مما يدمر المعلومات ويجعل الصورة غير قابلة للقراءة. تضمنت الحلول السابقة تحريك المكونات البصرية لإزاحة النسخة إلى مواضع مختلفة بمرور الوقت، لكن هذا كان يتطلب مسحاً ميكانيكياً. وكانت هذه العملية بطيئة، وعرضة للتآكل الميكاني، وجعلت من المستحيل التقاط الأجسام سريعة الحركة لأن النظام كان يحتاج إلى التقاط العديد من الصور على مدى عدة ثوانٍ لبناء صورة كاملة.

استبدل الباحثون هذه الحركة الميكانيكية بتغيير في لون الضوء. فقد استخدموا محززاً خاصاً يكسر الضوء بناءً على طوله الموجي، أو لونه. وعندما قاموا بتغيير لون الضوء، تغيرت الزاوية التي انكسر بها الضوء، مما أدى بدوره إلى تحريك موضع الصورة الشبحية. وقد اختبروا طريقتين للقيام بذلك؛ في الأولى، قاموا بمسح مجموعة من الألوان واحداً تلو الآخر، مع التقاط صورة عند كل خطوة. وفي الثانية، وهي الابتكار الأكثر قوة، قاموا بإضاءة العينة بثلاثة ألوان متميزة من الضوء - الأزرق والأخضر والأحمر - في وقت واحد. والتقطت كاميرا ملونة قياسية صورة واحدة تحتوي على جميع نسخ المشهد. ولأن كل لون أنشأ صورة شبحية في موقع مختلف قليلاً، فقد سجلت الكاميرا ثلاثة أنماط متداخلة في إطار واحد.

ولفهم هذه اللقطة الواحدة المعقدة، ابتكر الفريق خوارزمية حاسوبية جديدة تعتمد على طريقة تسمى "الاشتقاق المتدرج" (gradient descent). تعمل هذه الخوارزمية كحلّال قوي يأخذ البيانات المتداخلة الفوضوية ويحدد بدقة كيفية فصل الصورة الحقيقية عن الصور الشبحية الثلاث. وهي تعمل من خلال تعديل تخمينها لما تبدو عليه الصورتان المنفصلتان بشكل متكرر حتى تتطابق الرياضيات تماماً مع البيانات المسجلة. والأهم من ذلك، أن هذه الخوارزمية الجديدة لا تحتاج إلى معرفة مسبقة ما إذا كانت الخلايا أكثر سمكاً أو رقة من محيطها، وهو شرط كان يحد من الطرق القديمة. كما أنها تتعامل مع حقيقة أن ألوان الضوء المختلفة تركز عند أعماق مختلفة قليلاً وتكبر الصورة بمقادلات مختلفة، مما يصحح هذه العيوب البصرية الطبيعية تلقائياً.

إن نتائج هذه الطريقة الجديدة مذهلة. فعندما اختبر الباحثون هذه الطريقة على هدف اختبار قياسي ذي هياكل محفورة، وجدوا أن جودة الصورة كانت تضاهي الطرق الميكانيكية الأقدم والأبطأ، ولكن مع الميزة الإضافية المتمثلة في القدرة على التعامل مع العينات الكثيفة. وقد أظهروا أن الخوارزمية الجديدة يمكنها فصل الصور بنجاح حتى عندما كان الإزاحة بين الشبح والكائن الحقيقي صغيرة جداً أو كبيرة جداً، وهو النطاق الذي فشلت فيه الطرق السابقة غالباً. والأهم من ذلك، أنهم أظهروا قوة نهج اللقطة الواحدة من خلال تصوير مستنبت من خلايا الخميرة المتحركة. ففي الثقافة الكثيفة، يكاد يكون من المستحيل العثور على بقعة لا تتداخل فيها الخلايا مع صورتها الشبحية. وباستخدام تقنية اللقطة الواحدة الجديدة، تمكن الفريق من التقاط حركة خلايا الخميرة في الوقت الفعلي، وتتبعها أثناء حركتها عبر الشريحة. ونجحت الخوارمة في فصل المشاهدتين، كاشفة عن البنية الحقيقية للخلايا دون الضبابية أو العيوب التي عادة ما تصيب مثل هذه العينات الكثيفة.

يمثل هذا العمل خطوة كبيرة للأمام في مجال التصوير البيولوجي. فمن خلال إلغاء الحاجة إلى المسح الميكانيكي وإزالة القيود المفروضة على كثافة العينات، ابتكر الباحثون أداة أكثر سرعة وتعددًا في الاستخدام. والنظام قوي ضد الاهتزازات البيئية لأنه يستخدم مسار ضوء مشترك، وهو سريع بما يكفي لتجميد حركة الخلايا الحية. وبينما يعني استخدام كاميرا ملونة انخفاضاً طفيفاً في أدق التفاصيل الممكنة مقارنة بمستشعر متخصص أبيض وأسود، فإن القدرة على رؤية الصورة الكاملة دفعة واحدة في بيئة مزدحمة تعد مكسباً كبيراً. لقد تحقق الفريق من صحة طريقتهم على الشبكات العصبية الثابتة والخميرة الحية، مما أظهر قدرتها على التعامل مع كل من الهياكل الديناميكية والمتحركة والأنظمة المعقدة. ويقدم هذا النهج طريقة عملية لدراسة العمليات البيولوجية المعقدة في الوقت الفعلي، مما يفتح الباب لمراقبة البيئات الخلوية المزدحمة التي كان من الصعب سابقاً تصويرها بوضوح.