Single-Shot Replica-Free Common-Path Quantitative Phase Imaging with Doubled Field of View

जीवित कोशिकाओं की अदृश्य दुनिया को बिना रंग (डाई) डाले या उन्हें मारे बिना देखने के लिए, वैज्ञानिक 'क्वांटिटेटिव फेज इमेजिंग' नामक तकनीक पर भरोसा करते हैं। नमूने द्वारा प्रकाश को अवशोषित करने के तरीके को देखने के बजाय, यह विधि इस बात को मापती है कि नमूना गुजरते समय प्रकाश को कितना धीमा कर देता है। चूंकि जीवित कोशिकाएं ज्यादातर पारदर्शी होती हैं, वे प्रकाश को रोकती नहीं हैं, लेकिन वे उनकी मोटाई और घनत्व के आधार पर उसे थोड़ा विलंबित कर देती हैं। इस सूक्ष्म विलंब को मापकर, शोधकर्ता कोशिका की संरचना का एक विस्तृत मानचित्र बना सकते हैं और यहाँ तक कि इसके शुष्क द्रव्यमान (dry mass) की गणना भी कर सकते हैं। इसे करने का सबसे स्थिर तरीका एक ऐसा सेटअप है जहाँ प्रकाश की किरण एक एकल, साझा पथ का अनुसरण करती है, जो इस प्रणाली को उन कंपन और तापमान परिवर्तनों के प्रति प्रतिरोधी बनाता है जो आमतौर पर नाजुक मापों को खराब कर देते हैं। हालाँकि, यह स्थिरता एक निराशाजनक समझौते के साथ आती है: मानक विधि एक "घोस्ट" (भूतिया) छवि बनाती है, जो नमूने की एक डुप्लिकेट छवि है जो वास्तविक एक के ऊपर ओवरलैप होती है। इस भ्रम से बचने के लिए, वैज्ञानिकों को पारंपरिक रूप से केवल विरल (sparse) नमूनों को देखने के लिए मजबूर होना पड़ा था जहाँ घोस्ट छवि वास्तविक वस्तु को स्पर्श नहीं करती है, जिससे कैमरा के दृश्य क्षेत्र का आधे से अधिक हिस्सा बेकार चला जाता है और घनी कोशिकाओं के झुंडों का अध्ययन करना असंभव हो जाता है।

वारसॉ यूनिवर्सिटी ऑफ टेक्नोलॉजी और नेन्स्की इंस्टीट्यूट ऑफ एक्सपेरिमेंटल बायोलॉजी के शोधकर्ताओं की एक टीम ने इस सीमा को तोड़ने का एक तरीका खोज लिया है। उन्होंने एक नई विधि विकसित की है जो घोस्ट छवि को पूरी तरह से हटा देती है, जिससे उन्हें एक ही क्षण में पूरे दृश्य क्षेत्र को देखने की अनुमति मिलती है, भले ही नमूना कोशिकाओं से भरा हो। उनका दृष्टिकोण, जिसे उनके हालिया कार्य में वर्णित किया गया है, पुराने सिस्टम के यांत्रिक चलते हुए हिस्सों को प्रकाश के रंग के चतुर उपयोग से बदल देता है। प्रकाश के रंग को बदलकर, वे लेंस या दर्पणों को हिलाए बिना घोस्ट छवि की स्थिति बदल सकते हैं। फिर वे वास्तविक छवि को घोष्ट छवि से गणितीय रूप से अलग करने के लिए एक परिष्कृत कंप्यूटर एल्गोरिदम का उपयोग करते हैं, जो प्रभावी रूप से कैमरा सेंसर पर उपयोगी स्थान को दोगुना कर देता है। यह घने, गतिशील जैविक नमूनों, जैसे कि यीस्ट कल्चर और न्यूरल नेटवर्क का स्पष्ट, उच्च-गति इमेजिंग करने की अनुमति देता है, जो पहले इस स्तर की स्पष्टता के साथ अध्ययन करने के लिए बहुत अधिक भीड़भाड़ वाले थे।

टीम ने जिस मुख्य समस्या को हल किया वह यह है कि ये माइक्रोस्कोप कैसे काम करते हैं। एक सामान्य-पथ (common-path) सेटअप में, प्रकाश जो नमूने से गुजरता है, वह अपने ही एक रूप (copy) के साथ हस्तक्षेप करता है जो थोड़ा बगल में स्थानांतरित किया गया है। यह हस्तक्षेप एक पैटर्न बनाता है जिसमें छवि को पुनर्गठित करने के लिए आवश्यक जानकारी होती है। हालाँकि, क्योंकि कॉपी स्थानांतरित है, यह अक्सर अंतिम चित्र में मूल नमूने के ठीक ऊपर आ जाती है। यदि नमूना विरल है, जिसमें कोशिकाओं के बीच पर्याप्त खाली स्थान है, तो कॉपी खाली क्षेत्र में गिरती है और कोई समस्या नहीं करती है। लेकिन यदि नमूना घना है, जैसे कि यीस्ट का एक भीड़भाड़ वाला पेट्री डिश, तो कॉपी वास्तविक कोशिकाओं के साथ ओवरलैप हो जाती है, जिससे जानकारी नष्ट हो जाती है और छवि अपठनीय हो जाती है। पिछले समाधानों में ऑप्टिकल घटकों को स्थानांतरित करने के लिए यांत्रिक स्कैनिंग शामिल थी, लेकिन यह धीमा था, यांत्रिक टूट-फूट के प्रति संवेदनशील था, और तेजी से चलने वाली वस्तुओं को कैप्चर करना असंभव बना देता था क्योंकि पूर्ण छवि बनाने के लिए सिस्टम को कई सेकंड में कई तस्वीरें लेनी पड़ती थीं।

शोधकर्ताओं ने इस यांत्रिक गति को प्रकाश के रंग में बदलाव से बदल दिया। उन्होंने एक विशेष ग्रेटिंग का उपयोग किया जो तरंग दैर्ध्य (wavelength), या रंग के आधार पर प्रकाश को मोड़ता है। जब उन्होंने प्रकाश का रंग बदला, तो प्रकाश के मुड़ने का कोण बदल गया, जिसने बदले में घोस्ट छवि की स्थिति को बदल दिया। उन्होंने दो तरीकों का परीक्षण किया। पहले में, उन्होंने एक-एक करके रंगों की एक श्रृंखला को स्कैन किया, प्रत्येक चरण पर एक तस्वीर ली। दूसरे में, जो अधिक शक्तिशाली नवाचार है, उन्होंने एक ही समय में तीन अलग-अलग रंगों के प्रकाश—नीला, हरा और लाल—से नमूने को रोशन किया। एक मानक कलर कैमरा एक ही फ्रेम में सभी तीन संस्करणों वाली एक एकल छवि कैप्चर करता है। चूंकि प्रत्येक रंग एक अलग स्थान पर घोस्ट छवि बनाता था, इसलिए कैमरे ने एक ही फ्रेम में तीन ओवरलैपिंग पैटर्न रिकॉर्ड किए।

इस जटिल सिंगल शॉट को समझने के लिए, टीम ने 'ग्रेडिएंट डिसेंट' नामक पद्धति पर आधारित एक नया कंप्यूटर एल्गोरिदम बनाया। यह एल्गोरिदम एक शक्तिशाली सॉल्वर की तरह कार्य करता है जो बिखरे हुए, ओवरलैपिंग डेटा को लेता है और यह पता लगाता है कि वास्तविक छवि को विभिन्न घोस्ट छवियों से कैसे अलग किया जाए। यह इस प्रक्रिया को दोहराते हुए (iteratively) अपने अनुमान को समायोजित करता है कि दो अलग-अलग छवियां कैसी दिखती हैं, जब तक कि गणित रिकॉर्ड किए गए डेटा से पूरी तरह मेल न खा जाए। महत्वपूर्ण रूप से, इस नए एल्गोरिदम को पहले से यह जानने की आवश्यकता नहीं है कि कोशिकाएं अपने परिवेश से मोटी हैं या पतली, जो कि पुरानी विधियों की एक सीमा थी। यह इस तथ्य को भी संभालता है कि प्रकाश के विभिन्न रंग थोड़े अलग गहराई पर फोकस होते हैं और छवि को अलग-अलग मात्रा में आवर्धित (magnify) करते हैं, जिससे प्राकृतिक ऑप्टिकल खामियों को स्वचालित रूप से ठीक किया जा सके।

इस नए तरीके के परिणाम आश्चर्यजनक हैं। जब शोधकर्ताओं ने नक्काशीदार संरचनाओं वाले एक मानक टेस्ट टारगेट पर इसका परीक्षण किया, तो उन्होंने पाया कि छवि की गुणवत्ता पुरानी, धीमी यांत्रिक विधियों जितनी ही अच्छी थी, लेकिन इसमें घने नमूनों को संभालने का अतिरिक्त लाभ भी था। उन्होंने दिखाया कि नया एल्गोरिदम छवियों को सफलतापूर्वक अलग कर सकता है, भले ही घोस्ट और वास्तविक वस्तु के बीच का अंतर बहुत कम या बहुत अधिक हो, एक ऐसी रेंज जहाँ पिछली विधियाँ अक्सर विफल हो जाती थीं। सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि उन्होंने गतिशील यीस्ट कोशिकाओं के कल्चर की इमेजिंग करके सिंगल-शॉट दृष्टिकोण की शक्ति का प्रदर्शन किया। एक घने कल्चर में, ऐसा स्थान खोजना लगभग असंभव है जहाँ कोशिकाएं अपनी ही घोस्ट छवि के साथ ओवरलैप न हों। अपनी नई सिंगल-शॉट तकनीक का उपयोग करते हुए, टीम ने यीस्ट कोशिकाओं की गति को वास्तविक समय में कैप्चर किया, और स्लाइड पर उनके चलते रहने के दौरान उन्हें ट्रैक किया। एल्गोरिदम ने दो दृश्यों को सफलतापूर्वक अलग कर दिया, जिससे कोशिकाओं की वास्तविक संरचना स्पष्ट हुई, बिना उस धुंधलेपन या आर्टिफैक्ट्स के जो आमतौर पर ऐसे घने नमूनों में होता है।

यह कार्य जैविक इमेजिंग में एक महत्वपूर्ण प्रगति का प्रतिनिधित्व करता है। यांत्रिक स्कैनिंग की आवश्यकता को समाप्त करके और नमूना घनत्व की प्रतिबंध को हटाकर, शोधकर्ताओं ने एक ऐसा उपकरण बनाया है जो तेज़ और अधिक बहुमुखी है। यह सिस्टम पर्यावरणीय कंपन के प्रति मजबूत है क्योंकि यह एक साझा प्रकाश पथ का उपयोग करता है, और यह जीवित कोशिकाओं की गति को फ्रीज करने के लिए पर्याप्त तेज़ है। हालांकि रंगीन कैमरे के उपयोग का अर्थ एक विशेष ब्लैक-एंड-व्हाइट सेंसर की तुलना में सूक्ष्म विवरणों में थोड़ी कमी है, लेकिन भीड़भाड़ वाले वातावरण में एक साथ पूरी तस्वीर देखने की क्षमता एक बड़ा लाभ है। टीम ने अपने तरीके को स्थिर न्यूरल नेटवर्क और जीवित यीस्ट पर सत्यापित किया, जिससे यह सिद्ध हुआ कि यह स्थिर, विस्तृत संरचनाओं और गतिशील, चलती प्रणालियों दोनों को संभाल सकता है। यह दृष्टिकोण जटिल जैविक प्रक्रियाओं का वास्तविक समय में अध्ययन करने का एक व्यावहारिक तरीका प्रदान करता है, जो उन भीड़भाड़ वाले कोशिकीय वातावरणों को देखने के द्वार खोलता है जिन्हें पहले स्पष्ट रूप से इमेज करना बहुत कठिन था।