Single-Shot Replica-Free Common-Path Quantitative Phase Imaging with Doubled Field of View

Om de onzichtbare wereld van levende cellen te zien zonder ze met kleurstoffen te verven of te doden, vertrouwen wetenschappers op een techniek genaamd kwantitatieve fase-imaging. In plaats van te kijken naar hoe een monster licht absorbeert, meet deze methode hoe een monster het licht vertraagt terwijl het erdoorheen gaat. Omdat levende cellen grotendeels transparant zijn, blokkeren ze het licht niet, maar ze vertragen het wel een klein beetje, afhankelijk van hun dikte en dichtheid. Door deze minuscule vertraging te meten, kunnen onderzoekers een gedetailleerde kaart van de structuur van een cel maken en zelfs de droge massa ervan berekenen. Een van de meest stabiele manieren om dit te doen, is met een opstelling waarbij de lichtstraal een enkel, gedeeld pad aflegt, waardoor het systeem bestand is tegen de trillingen en temperatuurschommelingen die delicate metingen gewoonlijk verpesten. Deze stabiliteit gaat echter gepaard met een frustrerende afruil: de standaardmethode creëert een "geestbeeld", een duplicaat van het monster dat over het echte beeld heen valt. Om deze verwarring te vermijden, zijn wetenschappers er traditioneel toe gedwongen geweest om alleen naar ijle monsters te kijken waarbij de geest het echte object niet raakt, wat effectief meer dan de helft van het gezichtsveld van de camera wegwerpt en het onmogelijk maakt om dichte groepen cellen te bestuderen.

Een team van onderzoekers van de Technische Universiteit van Warschau en het Nencki Instituut voor Experimentele Biologie heeft een manier gevonden om deze beperking te doorbreken. Ze hebben een nieuwe methode ontwikkeld die het geestbeeld volledig verwijdert, waardoor ze in één enkel moment het volledige gezichtsveld kunnen zien, zelfs wanneer het monster vol zit met cellen. Hun aanpak, beschreven in hun recente werk, vervangt de mechanische bewegende onderdelen van oudere systemen door een slim gebruik van lichtkleur. Door de kleur van de lichtbron te verschuiven, kunnen ze de positie van het geestbeeld veranderen zonder lenzen of spiegels te bewegen. Vervolgens gebruiken ze een geavanceerd computeralgoritme om het echte beeld wiskundig te scheiden van het geestbeeld, wat de bruikbare ruimte op de camerasensor effectief verdubbelt. Dit maakt het mogelijk om heldere, snelle beelden te maken van dichte, bewegende biologische monsters, zoals gistculturen en neurale netwerken, die voorheen te druk waren om met deze mate van helderheid te bestuderen.

De kern van het probleem dat het team heeft opgelost, ligt in de werking van deze microscopen. In een 'common-path' opstelling interfereert het licht dat door het monster gaat met een kopie van zichzelf die iets opzij is verschoven. Deze interferentie creëert een patroon dat de informatie bevat die nodig is om het beeld te reconstrueren. Omdat de kopie echter is verschoven, landt deze vaak direct bovenop het originele monster in de uiteindelijke afbeelding. Als het monster ijl is, met veel lege ruimte tussen de cellen, landt de kopie in het lege gebied en veroorzaakt dat geen problemen. Maar als het monster dicht is, zoals een drukke petrischaal met gist, overlapt de kopie met de echte cellen, wat de informatie vernietigt en het beeld onleesbaar maakt. Eerdere oplossingen hielden in dat de optische componenten werden bewogen om de kopie in verschillende posities te verschuiven over de tijd, maar dit vereiste mechanisch scannen. Dit proces was traag, gevoelig voor mechanische slijtage en maakte het onmogelijk om snelle objecten vast te leggen omdat het systeem meerdere foto's over enkele seconden moest maken om een compleet beeld op te bouwen.

De onderzoekers vervingen deze mechanische beweging door een verandering in de kleur van het licht. Ze gebruikten een speciaal rooster dat licht buigt op basis van de golflengte, of kleur. Wanneer ze de kleur van het licht veranderden, veranderde de hoek waaronder het licht boog, wat op zijn beurt de positie van het geestbeeld veranderde. Ze testten twee manieren om dit te doen. In de eerste methode scanden ze één voor één door een reeks kleuren door bij elke stap een foto te maken. In de tweede methode, die de krachtigere innovatie is, bestraalden ze het monster met drie verschillende kleuren licht — blauw, groen en rood — allemaal tegelijkertijd. Een standaardkleurencamera legde één enkel beeld vast dat alle drie de versies van de scène bevatte. Omdat elke kleur een geestbeeld op een iets andere locatie creëerde, registreerde de camera drie overlappende patronen in één enkel frame.

Om een zin te krijgen op deze complexe enkele opname, creëerde het team een nieuw computeralgoritme gebaseerd op een methode genaamd gradiëntafdaling (gradient descent). Dit algoritme werkt als een krachtige oplosser die de rommelige, overlappende gegevens neemt en precies uitrekent hoe het de echte afbeelding van de drie verschillende geestbeelden kan scheiden. Het werkt door iteratief een schatting te verfijnen van hoe de twee afzonderlijke beelden eruitzien, totdat de wiskunde perfect overeenkomt met de geregistreerde gegevens. Cruciaal is dat dit nieuwe algoritme niet vooraf hoeft te weten of de cellen dikker of dunner zijn dan hun omgeving, een vereiste die oudere methoden beperkte. Het corrigeert ook automatisch voor het feit dat verschillende kleuren licht op iets andere dieptes focussen en het beeld met verschillende hoeveelheden vergroten, wat natuurlijke optische afwijkingen betreft.

De resultaten van deze nieuwe methode zijn opmerkelijk. Wanneer de onderzoekers het testten op een standaard testdoel met geëtste structuren, ontdekten ze dat de kwaliteit van het beeld net zo goed was als die van de oudere, tragere mechanische methoden, maar met het extra voordeel dat het dichte monsters kan verwerken. Ze toonden aan dat het nieuwe algoritme de beelden succesvol kon scheiden, zelfs wanneer de verschuiving tussen de geest en het echte object zeer klein of zeer groot was, een bereik waar eerdere methoden vaak faalden. Het meest belangrijk was dat ze de kracht van de single-shot benadering demonstreerden door een cultuur van bewegende gistcellen te filmen. In een dichte cultuur is het bijna onmogelijk om een plek te vinden waar de cellen niet overlappen met hun eigen geestbeeld. Met hun nieuwe single-shot techniek slaagde het team erin de beweging van de gistcellen in realtime vast te leggen, waarbij ze de cellen volgden terwijl ze over de slide bewogen. Het algoritme scheidde de twee weergaven succesvol, waardoor de ware structuur van de cellen zichtbaar werd zonder de onscherpte of artefacten die dergelijke dichte monsters gewoonlijk teisteren.

Dit werk vormt een belangrijke stap voorwaarts voor biologische beeldvorming. Door de noodzaak van mechanisch scannen te elimineren en de beperking op de monsterdichtheid weg te nemen, hebben de onderzoekers een instrument gecreëerd dat zowel sneller als veelzijdiger is. Het systeem is robuust tegen omgevingsvibraties omdat het een gedeeld lichtpad gebruikt, en het is snel genoeg om de beweging van levende cellen te bevriezen. Hoewel het gebruik van een kleurencamera een lichte vermindering van de fijnste details betekent vergeleken met een gespecialiseerde zwart-wit sensor, is het vermogen om in één keer het hele plaatje te zien in een drukke omgeving een grote winst. Het team valideerde hun methode op vaste neurale netwerken en levende gist, waarmee werd aangetoond dat het zowel statische, gedetailleerde structuren als dynamische, bewegende systemen kan verwerken. Deze aanpak biedt een praktische manier om complexe biologische processen in realtime te bestuderen, wat de deur opent naar het observeren van dichte cellulaire omgevingen die voorheen te moeilijk waren om helder in beeld te brengen.