Single-Shot Replica-Free Common-Path Quantitative Phase Imaging with Doubled Field of View

Para ver el mundo invisible de las células vivas sin teñirlas con colorantes ni matarlas, los científicos confían en una técnica llamada imagen de fase cuantitativa. En lugar de observar cómo una muestra absorbe la luz, este método mide cómo la muestra ralentiza la luz al pasar a través de ella. Debido a que las células vivas son mayoritariamente transparentes, no bloquean la luz, pero sí la retrasan ligeramente dependiendo de su grosor y densidad. Al medir este diminuto retraso, los investigadores pueden crear un mapa detallado de la estructura de una célula e incluso calcular su masa seca. Una de las formas más estables de hacer esto es utilizando una configuración donde el haz de luz viaja por una trayectoria única y compartida, lo que hace que el sistema sea resistente a las vibraciones y cambios de temperatura que suelen arruinar las mediciones delicadas. Sin embargo, esta estabilidad conlleva un intercambio frustrante: el método estándar crea una imagen "fantasma", un duplicado de la muestra que se superpone con la real. Para evitar esta confusión, los científicos se han visto obligados tradicionalmente a observar solo muestras dispersas donde el fantasma no toca el objeto real, lo que efectivamente desperdicia más de la mitad del área de visión de la cámara y hace imposible el estudio de multitudes densas de células.

Un equipo de investigadores de la Universidad Tecnológica de Varsovia y del Instituto Nencki de Biología Experimental ha encontrado una forma de romper esta limitación. Han desarrollado un nuevo método que elimina la imagen fantasma por completo, permitiendo ver todo el campo de visión en un solo instante, incluso cuando la muestra está repleta de células. Su enfoque, descrito en su trabajo reciente, reemplaza las partes mecánicas móviles de los sistemas antiguos por un uso ingenioso del color de la luz. Al cambiar el color de la fuente de luz, pueden cambiar la posición de la imagen fantasma sin mover lentes ni espejos. Luego, utilizan un algoritmo computacional sofisticado para separar matemáticamente la imagen real del fantasma, duplicando efectivamente el espacio utilizable en el sensor de la cámara. Esto permite la obtención de imágenes claras y de alta velocidad de muestras biológicas densas y en movimiento, como cultivos de levadura y redes neuronales, que anteriormente eran demasiado densos para ser estudiados con este nivel de claridad.

El núcleo del problema que el equipo resolvió reside en cómo funcionan estos microscopios. En una configuración de trayectoria común, la luz que pasa a través de la muestra interfiere con una copia de sí misma que ha sido desplazada ligeramente hacia un lado. Esta interferencia crea un patrón que contiene la información necesaria para reconstruir la imagen. Sin embargo, debido a que la copia está desplazada, a menudo cae justo encima de la muestra original en la imagen final. Si la muestra es dispersa, con mucho espacio vacío entre las células, la copia cae en el área vacía y no causa problemas. Pero si la muestra es densa, como un plato de Petri lleno de levadura, la copia se superpone con las células reales, destruyendo la información y haciendo que la imagen sea ilegible. Las soluciones anteriores consistían en mover los componentes ópticos para desplazar la copia a diferentes posiciones a lo largo del tiempo, pero esto requería un escaneo mecánico. Este proceso era lento, propenso al desgaste mecánico y hacía imposible capturar objetos de movimiento rápido porque el sistema necesitaba tomar muchas imágenes durante varios segundos para construir una imagen completa.

Los investigadores reemplazaron este movimiento mecánico con un cambio en el color de la luz. Utilizaron una rejilla especial que dobla la luz basándose en su longitud de onda, o color. Cuando cambiaban el color de la luz, el ángulo en el que la luz se doblaba cambiaba, lo que a su vez movía la posición de la imagen fantasma. Probaron dos formas de hacer esto. En la primera, escanearon a través de un rango de colores uno por uno, tomando una foto en cada paso. En la segunda, que es la innovación más poderosa, iluminaron la muestra con tres colores distintos de luz —azul, verde y rojo— todos al mismo tiempo. Una cámara de color estándar capturó una sola imagen que contenía las tres versiones de la escena. Debido a que cada color creó una imagen fantasma en una ubicación ligeramente diferente, la cámara registró tres patrones superpuestos en un solo fotograma.

Para dar sentido a esta instantánea compleja, el equipo creó un nuevo algoritmo computacional basado en un método llamado descenso de gradiente. Este algoritmo actúa como un potente solucionador que toma los datos desordenados y superpuestos y determina exactamente cómo separar la imagen real de las tres imágenes fantasma. Funciona ajustando iterativamente su suposición de cómo se ven las dos imágenes separadas hasta que las matemáticas coinciden perfectamente con los datos registrados. Crucialmente, este nuevo algoritmo no necesita saber de antemano si las células son más gruesas o más delgadas que su entorno, un requisito que limitaba los métodos anteriores. También gestiona el hecho de que diferentes colores de luz se enfocan a profundidades ligeramente diferentes y magnifican la imagen en diferentes cantidades, corrigiendo automáticamente estas peculiaridades ópticas naturales.

Los resultados de este nuevo método son impactantes. Cuando los investigadores lo probaron en un objetivo de prueba estándar con estructuras grabadas, encontraron que la calidad de la imagen era tan buena como la de los métodos mecánicos más lentos, pero con la ventaja añadida de poder manejar muestras densas. Demostraron que el nuevo algoritmo podía separar con éxito las imágenes incluso cuando el desplazamiento entre el fantasma y el objeto real era muy pequeño o muy grande, un rango donde los métodos anteriores solían fallar. Lo más importante es que demostraron el poder del enfoque de toma única mediante la imagen de un cultivo de levaduras en movimiento. En un cultivo denso, es casi imposible encontrar un lugar donde las células no se superpongan con su propia imagen fantasma. Usando su nueva técnica de toma única, el equipo capturó el movimiento de las células de levadura en tiempo real, rastreándolas mientras se movían por el portaobjetos. El algoritmo separó con éxito las dos vistas, revelando la verdadera estructura de las células sin el desenfoque o los artefactos que suelen afectar a tales muestras densas.

Este trabajo representa un paso significativo adelante para la imagen biológica. Al eliminar la necesidad de escaneo mecánico y eliminar la restricción de la densidad de la muestra, los investigadores han creado una herramienta que es tanto más rápida como más versátil. El sistema es robusto contra las vibraciones ambientales porque utiliza una trayectoria de luz compartida, y es lo suficientemente rápido como para congelar el movimiento de las células vivas. Si bien el uso de una cámara de color significa una ligera reducción en el detalle más fino posible en comparación con un sensor especializado en blanco y negro, la capacidad de ver todo el panorama a la vez en un entorno de multitud es una ganancia importante. El equipo validó su método en redes neuronales fijas y levadura viva, demostrando que puede manejar tanto estructuras estáticas y detalladas como sistemas dinámicos y en movimiento. Este enfoque ofrece una forma práctica de estudiar procesos biológicos complejos en tiempo real, abriendo la puerta a la observación de entornos celulares densos que anteriormente eran demasiado difíciles de imaginar con claridad.