Single-Shot Replica-Free Common-Path Quantitative Phase Imaging with Doubled Field of View

染色剤で染めたり細胞を死滅させたりすることなく、目に見えない生細胞の世界を観察するために、科学者たちは「定量的位相イメージング」と呼ばれる技術に頼っています。この手法は、試料が光をどれだけ吸収するかを見るのではなく、試料を通過する際に光がどれだけ遅れるかを測定します。生細胞は大部分が透明であるため、光を遮ることはありませんが、その厚みや密度に応じて光をわずかに遅延させます。この微細な遅延を測定することで、研究者は細胞の構造の詳細なマップを作成し、さらにはその乾燥質量（ドライマス）を算出することさえできます。これを行う最も安定した方法の一つは、光のビームが単一の共有経路を移動するセットアップを使用することであり、これにより、繊細な測定を台無しにする振動や温度変化に対してシステムが耐性を持つようになります。しかし、この安定性には、もどかしいトレードオフが伴います。標準的な手法では、「ゴースト」画像、つまり試料の複製が実像と重なってしまう現象が発生します。この混乱を避けるために、科学者たちは伝統的に、ゴーストが実体と接触しないような疎な（まばらな）試料のみを観察することを余儀なくされており、これはカメラの視野領域の半分以上を事実上捨てていることになり、細胞が密集した状態での研究を不可能にしていました。

ワルシャワ工科大学とネンツキ実験生物学研究所の研究チームは、この限界を打破する方法を見出しました。彼らは、ゴースト画像を完全に除去し、サンプルが密集している場合でも、一度の操作で全視野を観察できる新しい手法を開発しました。彼らのアプローチは、最近の論文で説明されている通り、古いシステムの機械的な可動部品を、光の色を用いた巧妙な手法に置き換えるものです。光源の色を変化させることで、レンズやミラーを動かすことなく、ゴースト画像の配置を変えることができます。そして、高度なコンピュータ・アルゴリズムを使用して、実像とゴースト画像を数学的に分離し、カメラセンサー上の利用可能なスペースを実質的に倍増させます。これにより、以前はあまりに混雑していて明確に研究することができなかった、酵母培養物や神経ネットワークのような、高密度で動きのある生物学的試料の、鮮明かつ高速なイメージングが可能になります。

このチームが解決した問題の核心は、これらの顕微鏡の仕組みにあります。一般的なコモンパス（共通経路）セットアップでは、試料を通過した光が、横方向にわずかにずらされた自身のコピーと干渉します。この干渉によって、画像の再構成に必要な情報を含むパターンが生成されます。しかし、コピーは位置がずれているため、最終的な画像内で元の試料の真上に重なってしまうことがよくあります。試料が疎で、細胞間に十分な空隙がある場合は、コピーが空白領域に落ちるため問題にはなりません。しかし、酵母の密集したペトリ皿のように試料が密な場合、コピーが実際の細胞と重なり、情報を破壊して画像を判読不能にしてしまいます。以前の解決策は、光学部品を動かしてコピーの位置を時間の経過とともに異なる場所にシフトさせるものでしたが、これには機械的なスキャニングが必要でした。このプロセスは低速で、機械的な摩耗が起こりやすく、システムが完全な画像を構築するために数秒間にわたって多くの写真を撮る必要があるため、高速で動く物体を捉えることは不可能でした。

研究者たちは、この機械的な動きを光の色による変化に置き換えました。彼らは、波長（つまり色）に基づいて光を屈折させる特殊な回折格子を使用しました。光の色を変えると、光が曲がる角度が変わり、その結果、ゴースト画像の配置が移動します。彼らは2つの方法をテストしました。1つ目は、色の範囲を一つずつスキャンして、各ステップで写真を撮る方法です。2つ目は、より強力な革新である、青、緑、赤の3つの異なる色の光で試料を同時に照射する方法です。標準的なカラーカメラは、これら3つのバージョンのシーンを含む単一の画像をキャプチャします。各色がそれぞれ少し異なる場所にゴースト画像を作成するため、カメラは1フレーム内に3つの重なり合ったパターンを記録します。

この複雑なシングルショット（単一撮影）を理解するために、チームは「勾配降下法」と呼ばれる手法に基づいた新しいコンピュータ・アルゴリズムを作成しました。このアルゴリズムは、乱雑で重なり合ったデータを取り込み、実像と3つの異なるゴースト画像を正確に分離する強力なソルバー（解法器）として機能します。それは、推測される2つの画像がどのような見た目であるかを反復的に調整し、数学的な計算が記録されたデータと完全に一致するまで繰り返すことで機能します。決定的なことに、この新しいアルゴリズムは、細胞が周囲よりも厚いか薄いかを事前に知る必要はありません（これは古い手法を制限していた要件です）。また、異なる色の光がわずかに異なる深さに焦点を合わせ、異なる倍率で画像を拡大するという自然な光学的な癖も、自動的に補正します。

この新手法の結果は驚くべきものです。研究者がエッチングされた構造を持つ標準的なテストターゲットでテストしたところ、画像の品質は従来の低速な機械的手法と同等でありながら、高密度な試料を扱えるという利点が加わっていることがわかりました。彼らは、新しいアルゴリズムが、ゴーストと実体の間のシフトが非常に小さい場合でも非常に大きい場合でも、成功裏に画像を分離できることを示しました。これは、従来のメソッドがしばしば失敗した範囲です。最も重要なことに、彼らは動いている酵母細胞の培養物を撮像することで、シングルショット・アプローチの威力を実証しました。密集した培養物では、細胞が自身のゴーストと重ならない場所を見つけることはほぼ不可能です。この新しいシングルショット技術を用いることで、チームは酵母細胞の動きをリアルタイムで捉え、スライド上を移動する様子を追跡しました。アルゴリズムは2つのビューを正常に分離し、通常このような高密度なサンプルに見られるブレやアーティファクト（偽像）なしに、細胞の真の構造を明らかにしました。

この研究は、生物学的イメージングにおける重要な前進を意味します。機械的なスキャニングの必要性を排除し、試料密度の制限を取り除くことで、研究者たちはより高速で多用途なツールを作り上げました。共有光路を使用しているため、システムは環境振動に対して堅牢であり、生細胞の動きを止めることができるほど高速です。カラーカメラの使用により、専用の白黒センサーと比較して極めて微細なディテールがわずかに減少することはありますが、混雑した環境において一度に全体像を見ることができる能力は大きな利点です。チームは、固定された神経ネットワークと生きた酵母を用いて彼らの手法を検証し、それが静的で詳細な構造と、動的で動いているシステムの双方を扱えることを示しました。このアプローチは、複雑な生物学的プロセスをリアルタイムで研究するための実用的な方法を提供し、これまで鮮明にイメージングすることが困難であった、混雑した細胞環境の観察への扉を開くものです。