Single-Shot Replica-Free Common-Path Quantitative Phase Imaging with Doubled Field of View

Per vedere l'invisibile mondo delle cellule viventi senza colorarle con coloranti o ucciderle, gli scienziati si affidano a una tecnica chiamata imaging di fase quantitativa. Invece di osservare come un campione assorba la luce, questo metodo misura come il campione rallenti la luce mentre vi passa attraverso. Poiché le cellule viventi sono per lo più trasparenti, esse non bloccano la luce, ma la ritardano leggermente a seconda del loro spessore e della loro densità. Misurando questo minuscolo ritardo, i ricercatori possono creare una mappa dettagliata della struttura di una cellula e persino calcolarne la massa secca. Uno dei modi più stabili per farlo è utilizzare una configurazione in cui il fascio di luce percorre un percorso singolo e condiviso, rendendo il sistema resistente alle vibrazioni e ai cambiamenti di temperatura che solitamente rovinano le misurazioni delicate. Tuttavia, questa stabilità comporta un frustrante compromesso: il metodo standard crea un'immagine "fantasma", un duplicato del campione che si sovrappone a quello reale. Per evitare questa confusione, gli scienziati sono stati tradizionalmente costretti a osservare solo campioni sparsi, dove il fantasma non tocca l'oggetto reale, scartando di fatto più della metà dell'area visiva della telecamera e rendendo impossibile lo studio di densi assembramenti di cellule.

Un team di ricercatori della Politecnica di Varsavia e dell'Istituto Nencki di Biologia Sperimentale ha trovato un modo per rompere questo limite. Hanno sviluppato un nuovo metodo che rimuove completamente l'immagine fantasma, permettendo di vedere l'intero campo visivo in un unico istante, anche quando il campione è affollato di cellule. Il loro approccio, descritto nel loro recente lavoro, sostituisce le parti meccaniche in movimento dei sistemi più vecchi con un uso ingegnoso del colore della luce. Cambiando il colore della sorgente luminosa, possono modificare la posizione dell'immagine fantasma senza muovere lenti o specchi. Utilizzano poi un sofisticato algoritmo informatico per separare matematicamente l'immagine reale dal fantasma, raddoppiando efficacemente lo spazio utilizzabile sul sensore della telecamera. Ciò consente l'imaging chiaro e ad alta velocità di campioni biologici densi e in movimento, come le colture di lievito e le reti neurali, che prima erano troppo affollati per essere studiati con tale chiarezza.

Il cuore del problema che il team ha risolto risiede nel modo in cui funzionano questi microscopi. In una configurazione a percorso comune, la luce che passa attraverso il campione interferisce con una copia di se stessa che è stata spostata leggermente di lato. Questa interferenza crea un modello che contiene le informazioni necessarie per ricostruire l'immagine. Tuttavia, poiché la copia è spostata, spesso finisce proprio sopra il campione originale nell'immagine finale. Se il campione è sparso, con molto spazio vuoto tra le cellule, la copia cade nell'area vuota e non causa problemi. Ma se il campione è denso, come un affollato piattino di lievito, la copia si sovrappone alle cellule reali, distruggendo l'informazione e rendendo l'immagine illeggibile. Le soluzioni precedenti consistevano nello spostare i componenti ottici per traslare la copia in diverse posizioni nel tempo, ma ciò richiedeva una scansione meccanica. Questo processo era lento, soggetto a usura meccanica e rendeva impossibile catturare oggetti in rapido movimento perché il sistema doveva scattare molte immagini nell'arco di diversi secondi per costruire un'immagine completa.

I ricercatori hanno sostituito questo movimento meccanico con un cambiamento nel colore della luce. Hanno utilizzato un reticolo speciale che piega la luce in base alla sua lunghezza d'onda, o colore. Quando cambiavano il colore della luce, l'angolo con cui la luce veniva deviata cambiava, il che a sua volta spostava la posizione dell'immagine fantasma. Hanno testato due modi per farlo. Nel primo, hanno scansionato una gamma di colori uno alla volta, scattando una foto per ogni passaggio. Nel secondo, che è l'innovazione più potente, hanno illuminato il campione con tre colori distinti di luce — blu, verde e rosso — tutti contemporaneamente. Una telecamera a colori standard ha catturato un'unica immagine contenente tutte e tre le versioni della scena. Poiché ogni colore creava un'immagine fantasma in una posizione leggermente diversa, la telecamera ha registrato tre modelli sovrapposti in un unico fotogramma.

Per dare un senso a questo complesso scatto singolo, il team ha creato un nuovo algoritmo informatico basato su un metodo chiamato discesa del gradiente. Questo algoritmo agisce come un potente risolutore che prende i dati disordinati e sovrapposti e capisce esattamente come separare l'immagine reale dalle tre diverse immagini fantasma. Funziona regolando iterativamente la sua ipotesi di come appaiano le due immagini separate finché la matematica non corrisponde perfettamente ai dati registrati. Fondamentalmente, questo nuovo algoritmo non ha bisogno di sapere in anticipo se le cellule sono più spesse o più sottili rispetto al loro ambiente, un requisito che limitava i metodi precedenti. Gestisce anche il fatto che diversi colori di luce si focalizzano a profondità leggermente diverse e ingrandiscono l'immagine in modo differente, correggendo automaticamente queste naturali anomalie ottiche.

I risultati di questo nuovo metodo sono sorprendenti. Quando i ricercatori lo hanno testato su un bersaglio di prova standard con strutture incise, hanno scoperto che la qualità dell'immagine era altrettanto buona dei vecchi metodi meccanici più lenti, ma con il vantaggio aggiuntivo di poter gestire campioni densi. Hanno dimostrato che il nuovo algoritmo poteva separare con successo le immagini anche quando lo spostamento tra il fantasma e l'oggetto reale era molto piccolo o molto grande, un intervallo in cui i metodi precedenti spesso fallivano. Soprattutto, hanno dimostrato la potenza dell'approccio a scatto singolo con l'imaging di una cultura di cellule di lievito in movimento. In una cultura densa, è quasi impossibile trovare un punto in cui le cellule non si sovrappongano alla propria immagine fantasma. Utilizzando la loro nuova tecnica a scatto singolo, il team ha catturato il movimento delle cellule di lievito in tempo reale, tracciandole mentre si muovevano attraverso il vetrino. L'algoritmo ha separato con successo le due viste, rivelando la vera struttura delle cellule senza la sfocatura o gli artefatti che solitamente affliggono tali campioni densi.

Questo lavoro rappresenta un passo avanti significativo per l'imaging biologico. Eliminando la necessità di scansione meccanica e rimuovendo la restrizione sulla densità del campione, i ricercatori hanno creato uno strumento che è sia più veloce che più versatile. Il sistema è robusto contro le vibrazioni ambientali perché utilizza un percorso luminoso condiviso, ed è abbastanza veloce da "congelare" il movimento delle cellule viventi. Sebbene l'uso di una telecamera a colori comporti una leggera riduzione del dettaglio più fine rispetto a un sensore specializzato in bianco e nero, la capacità di vedere l'intera scena in un colpo solo in un ambiente affollato è un grande guadagno. Il team ha validato il loro metodo su reti neurali fisse e lievito vivo, dimostrando che può gestire sia strutture statiche e dettagliate, sia sistemi dinamici e in movimento. Questo approccio offre un modo pratico per studiare processi biologici complessi in tempo reale, aprendo la porta all'osservazione di ambienti cellulari affollati che prima erano troppo difficili da immagini con chiarezza.