Single-Shot Replica-Free Common-Path Quantitative Phase Imaging with Doubled Field of View

为了在不使用染料染色或杀死细胞的情况下观察活细胞的隐形世界，科学家们依赖一种被称为定量相位成像的技术。这种方法不是观察样本如何吸收光，而是测量样本在穿过时如何减慢光速。由于活细胞大多是透明的，它们不会阻挡光线，但会根据其厚度和密度使光线产生轻微延迟。通过测量这种微小的延迟，研究人员可以创建细胞结构的详细图谱，甚至计算其干质量。实现这一目标最稳定的方法之一是使用光束沿单一共享路径传播的装置，这使得系统能够抵抗通常会破坏精密测量的振动和温度变化。然而，这种稳定性带来了一个令人沮丧的权衡：标准方法会产生一个“幽灵”图像，即样本的一个重叠在真实样本上的副本。为了避免这种混乱，科学家们传统上被迫只能观察稀疏的样本，即幽灵图像不会接触到真实物体的情况，这实际上浪费了超过一半的摄像机视野，使得研究密集的细胞群变得不可能。

华沙理工大学和内恩茨基实验生物学研究所的研究团队找到了一种打破这一限制的方法。他们开发出一种新方法，可以完全消除幽灵图像，从而实现即使在样本密集的条件下也能在瞬间看到完整的视野。他们的研究方法（如其近期工作中所述）用对光色的巧妙利用取代了旧系统的机械运动部件。通过改变光源的颜色，他们可以在不移动透镜或镜子的情况下改变幽灵图像的位置。然后，他们使用一种复杂的计算机算法在数学上将真实图像与幽灵图像分离，从而有效地使摄像机传感器的可用空间翻倍。这使得对密集、移动的生物样本（如酵母培养物和神经网络）进行清晰、高速成像成为可能，而这些样本此前因过于拥挤而难以研究。

该团队解决的核心问题在于这些显微镜的工作原理。在常见的共路径设置中，穿过样本的光线会与自身一个略微偏移的副本发生干涉。这种干涉产生了一种包含重建图像所需信息的图案。然而，由于副本发生了偏移，它在最终图像中往往会落在原始样本的正上方。如果样本是稀疏的，即细胞之间有足够的空隙，副本就会落在空白区域，不会造成麻烦。但如果样本是密集的，比如拥挤的酵药培养皿，副本就会与真实的细胞重叠，从而破坏信息并导致图像无法读取。以前的解决方案涉及移动光学组件，以随时间推移将副本移动到不同的位置，但这需要机械扫描。这个过程速度缓慢，容易发生机械磨损，并且因为系统需要花费数秒钟拍摄多张照片来构建完整图像，因此无法捕捉快速移动的物体。

研究人员用改变光的颜色取代了这种机械运动。他们使用了一种特殊的衍射光栅，这种光栅会根据波长（或颜色）弯曲光线。当他们改变光的颜色时，光线弯曲的角度也会随之改变，进而改变了幽灵图像的位置。他们测试了两种方法。第一种方法是一个接一个地扫描一系列颜色并拍照。第二种方法——也是更强大的创新之处——是同时用三种不同的光色（蓝、绿、红）照射样本。一台标准的彩色摄像机捕捉了一张包含所有三个场景版本的单张图像。由于每种颜色都产生了一个位于略微不同位置的幽灵图像，摄像机在单帧图像中记录了三个重叠的图案。

为了理解这种复杂的单次快照，团队创建了一种基于梯度下降法的全新计算机算法。该算法就像一个强大的求解器，能够处理杂乱、重叠的数据，并准确判断如何将真实图像与三个不同的幽灵图像分离。它的工作原理是通过迭代调整对两个独立图像外观的猜测，直到数学结果与记录的数据完美匹配。至关重要的是，这种新算法不需要预先知道细胞是比周围环境更厚还是更薄，而这曾是限制旧方法的要求。它还能自动处理不同颜色的光聚焦在略微不同深度以及放大倍率不同的现象，从而修正这些自然的物理光学偏差。

研究结果非常显著。当研究人员在带有蚀刻结构的标准测试靶标上测试该方法时，他们发现图像质量与旧有的、速度较慢的机械方法一样好，但增加了处理密集样本的能力。他们展示了新算法即使在偏移量极小或极大时也能成功分离图像，而这正是以往方法经常失败的范围。最重要的是，他们通过对移动酵母细胞培养物的成像展示了单次拍摄法的威力。在密集的培养物中，几乎不可能找到一个细胞不会与其自身幽默图像重叠的点。利用这种新的单次拍摄技术，团队捕捉到了酵母细胞运动的实时画面，追踪它们在载玻片上的移动。算法成功分离了两个视图，揭示了细胞的真实结构，而没有出现通常会在此类密集样本中产生的模糊或伪影。

这项工作代表了生物成像领域的重要进步。通过消除对机械扫描的需求并移除对样本密度的限制，研究人员创造了一种既快速又多功能的工具。由于使用了共享光路，该系统对环境振动具有鲁棒性，并且其速度足以捕捉活细胞的运动。虽然使用彩色摄像机意味着与专门的黑白传感器相比在精细细节上略有下降，但能在拥挤环境中一次性看到全景是一个巨大的提升。团队在固定的神经网络和活体酵母上验证了其方法，表明它可以处理静态、详细的结构以及动态、移动的系统。这种方法为实时研究复杂的生物过程提供了一种实用的途径，为观察此前难以清晰成像的拥挤细胞环境打开了大门。