Cytotoxic and antibacterial diketopiperazine cyclic dipeptides from Streptomyces canescens associated with marine sponge Haliclona caerulea

ملخص تقني: ثنائي بيبرازين حلقي من نوع ديكيتو بيبرازين (DKPs) ذو سمية خلوية ومضاد للبكتيريا مستخلص من نوع Streptomyces canescens

بيان المشكلة
أدى التهديد العالمي المتزايد لمقاومة المضادات الحيوية والحاجة الملحة لمصادر مستدامة للمركبات النشطة بيولوجياً الجديدة إلى استكشاف النظم البيئية الميكروبية البحرية. وتُعرف الإسفنجات البحرية، ولا سيما من جنس Haliclona، باحتوائها على مجتمعات بكتيرية متنوعة، بما في ذلك أنواع Streptomyces، التي تعمل كمصادر غزيرة لمركبات الأيض الثانوية. وبينما قدمت إسفنجات Haliclona أنواعاً مختلفة من القلويات، فإن مركبات 2,5-ديكيتو بيبرازين (DKPs) القائمة على البرولين والمشتقة تحديداً من المتعايشات من نوع Streptomyces المرتبطة بـ Haliclosa caerulea لا تزال غير مستكشفة بشكل كافٍ. تعالج هذه الدراسة الفجوة المعرفية المتعلقة بالتنوع الكيميائي والنشاط البيولوجي لمركبات الـ DKPs من هذه العلاقة التكافلية البحرية المحددة، بهدف تحديد ركائز محتملة للعلاجات المضادة للبكتيريا والمضادة للسرطان.

المنهجية
استخدم البحث نهجاً متعدد التخصصات يجمع بين علم الأحياء الدقيقة، وكيمياء المنتجات الطبيعية، والبيولوجيا الحسابية:

1. جمع العينات وعزلها: تم جمع الإسفنج البحري Haliclona caerulea من جزيرة لارك في الخليج الفارسي. وتم عزل البكتيريا المرتبطة باستخدام تقنيات ميكروبيولوجية قياسية على وسط "نشا-مستخلص الخميرة-ببتون" (SYPA) ووسط "إسفنج بحري" (MSA).
2. تحديد السلالة: تم توصيف السلالة الأكثر قوة، والتي سُميت AHL19، من خلال الاختبارات المورفولوجية والكيميائية الحيوية والفيزيولوجية. وتم تأكيد التحديد الجزيئي عبر تسلسل جين 16S rRNA والتحليل الفيلوجيني، مما حدد السلالة على أنها Streptomyces canescens.
3. التخمير والاستخلاص: تمت زراعة السلالة في أوساط تخمير محسنة. وحصل على المستخلصات الخام باستخدام خلات الإيثيل. ولعزل مركبات محددة، خضع المستخلص الخام لعملية تجزئة الاستخلاص سائل-سائل (LLE) إلى أجزاء من n-هكسان، وثنائي كلورو ميثان (DCM)، وأجزاء الميثانول المائي.
4. فحص النشاط البيولوجي:
   • مضاد للبكتيريا: أُجريت اختبارات التركيز المثبط الأدنى (MIC) ضد Staphylococcus aureus، وMicrococcus luteus، وEscherichia coli، وPseudomonas aeruginosa.
   • السمية الخلوية: استُخدم اختبار اختزال MTT لتقييم السمية الخلوية ضد خط خلايا سرطان القولون والمستقيم البشري (HT29).
5. توضيح البنية: خضع جزء DCM النشط بيولوجياً لعملية كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC) شبه تحضيرية. وتم عزل ستة مركبات وتوصيفها باستخدام LC-ESI-MS وتقنيات الرنين المغناطيسي النووي (NMR) أحادية وثنائية الأبعاد (1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC).
6. الدراسات الحسابية:
   • الالتحام الجزيئي (Molecular Docking): تم إجراء عملية الالتحام لمركبات الـ DKPs المعزولة مقابل أهداف بكتيرية (DNA gyrase A، وDNA gyrase B، وDihydrofolate reductase [DHFR]) ومقابل هدف متعلق بالسرطان (β-tubulin) للتنبؤ بقوى الارتباط وأنماط التفاعل.
   • محاكاة الديناميكا الجزيئية (MD Simulation): أُجريت عمليات محاكاة لمدة 100 نانو ثانية لتقييم الاستقرار الهيكلي واستمرار التفاعل للمركب الأفضل أداءً (المركب 5) مع DHFR وβ-tubulin، مقارنة بالمضاد الحيوي القياسي ستريبتومايسين.

المساهمات الرئيسية والنتائج

• عزل المستقلبات النشطة بيولوجياً الجديدة: نجحت الدراسة في عزل وتوصيف ستة من مركبات 2,5-ديكيتو بيبرازين (DKPs) القائمة على البرولين من جزء DCM الخاص بـ S. canescens AHL19:

  1. Cyclo (L-Pro-L-Val)
  2. Cyclo (L-Pro-L-Ile)
  3. Cyclo (L-Pro-L-Leu)
  4. Cyclo (L-Pro-L-Phe)
  5. Cyclo (L-Pro-L-Tyr)
  6. Cyclo (4-hydroxy-L-Pro-L-Phe)
     ويمثل هذا أول تقرير لهذه الـ DKPs المحددة من المتعايشات المرتبطة بـ H. caerulea.

• النشاط المضاد للبكتيريا: أظهر مستخلص خلات الإيثيل الخام نشاطاً مضاداً للبكتيريا واسع الطيف مع قيم MIC تتراوح بين 64 إلى 256 ميكروغرام/مل ضد الممرضات الموجبة والسالبة لصبغة جرام. وقد تم اختيار جزء DCM، الذي يحتوي على الـ DKPs المعزولة، لمزيد من الدراسة نظراً لسميته الخلوية القوية.

• السمية الخلوية: أظهر جزء DCM سمية خلوية قوية ضد خلايا HT29 بقيمة IC50 بلغت 4.0 ± 0.7 ميكروغرام/مل. وأظهر جزء الميثانول المائي قدرة أعلى (IC50 بلغت 1.9 ± 0.3 ميكروغرام/مل)، ومع ذلك تم إعطاء الأولوية لجزء DCM في عزل المركبات بناءً على ملفه الكيميائي.

• الرؤى الحسابية:

  • اختيار الهدف: كشف الالتحام الجزيئي أن الـ DKPs المعزولة لم تظهر ألفة ارتباط كبيرة لـ DNA gyrase A أو B. ومع ذلك، فقد أظهرت تفاعلات واعدة مع DHFR وβ-tubulin.
  • تفوق المركب 5: أظهر المركب Cyclo (L-Pro-L-Tyr) (المركب 5) أعلى ألفة ارتباط بين المركبات المختبرة. حيث حقق درجة التحام بلغت -8.108 كيلو سعرة/مول ضد DHFR و-9.599 كيلو سعرة/مول ضد β-tubulin، متفوقاً على الستريبتومايسين في اختبار DHFR.
  • دور مجموعات الهيدروكسيل: تم تحديد وجود مجموعة هيدروكسيل على حلقة الفينيل في المركب 5 كعنصر حاسم لتعزيز الارتباط، حيث شكلت روابط هيدروجينية إضافية مع بقايا Thr122 (في DHFR) وGln134 (في β-tubulin).
  • استقرار محاكاة الديناميكا الجزيئية (MD): أكدت محاكاة MD أن معقد المركب 5-DHFR أظهر استقراراً هيكلياً أكبر (تقلبات أقل في RMSD) وتفاعلات رئيسية أكثر استمراراً مقارنة بمعقد ستريبتومايسين-DHFR عبر مسار 100 نانو ثانية. كما لوحظ استقرار مماثل لمعقد المركب 5-β-tubulin.

الأهمية والادعاءات
يدعي المؤلفون أن هذه الدراسة هي أول تقرير عن الـ DKPs القائمة على البرولين المعزولة من Streptomyces canescens المرتبطة بالإسفنج البحري Haliclona caerulea. ويؤكد البحث على التنوع البيولوجي غير المستغل للمتعايشات البحرية كمصدر مستدام لاكتشاف الأدوية.

وتفترض الورقة أن مركبات الـ DKPs القائمة على البرولين هذه، بما تتميز به من صلابة شكلية ودرجات متفاوتة من التأثيرات المضادة للبكتيريا والسمية الخلوية، تعد ركائز دوائية واعدة. وبشكل خاص، يتم تسليط الضوء على المركب 5 كمركب طبي قوي قادر على استهداف DHFR البكتيري وβ-tubulin المرتبط بالسرطان بفعالية. وتخلص الدراسة إلى أن هذه النتائج تدعم إمكانات النظم البيئية الميكروبية البحرية في مواجهة مقاومة المضادات الحيوية والأمراض الورمية، مما يمهد الطريق لمزيد من التحقيقات في آليات العمل، والتخليق شبه الكيميائي، والتطبيقات السريرية لهذه الديبيبتات الحلقية.