Cytotoxic and antibacterial diketopiperazine cyclic dipeptides from Streptomyces canescens associated with marine sponge Haliclona caerulea

技術要約：Streptomyces canescens由来の細胞毒性および抗菌性ジケトピペラジン型環状ジペプチド

問題提起
抗生物質耐性の世界的な脅威の高まりと、新規の生物活性化合物の持続可能な供給源に対する緊急のニーズは、海洋微生物生態系の探索を加速させている。海綿動物、特にHaliclona属は、Streptomyces属を含む多様な細菌コミュニティを宿していることが知られており、これらは二次代謝物の豊富な生産源として機能する。しかし、Haliclona caeruleaの共生体であるStreptomyces種に特化したプロリンベースの2,5-ジケトピペラジン（DKP）については、依然として未開拓の領域である。本研究は、この特定の海洋共生関係におけるDKPの化学的多様性と生物活性に関する知識の空白を埋めることを目的とし、抗菌および抗がん治療のための潜在的なリード化合物の特定を目指している。

方法論
本研究では、微生物学、天然物化学、および計算生物学を組み合わせた多角的なアプローチを採用した：

1. 試料採取および分離： ララク島（ペルシャ湾）から海綿動物Haliclona caeruleaを採取した。関連細菌は、スターチ・イーストエキス・ペプトン・アガー（SYPA）および海洋海綿アガー（MSA）を用いた標準的な微生物学的手法を用いて単離した。
2. 菌株の同定： 最も強力な分離株（AHL19と命名）について、形態学的、生化学的、および生理学的試験による特性評価を行った。分子同定は16S rRNA遺伝子配列解析および系統解析を通じて行われ、当該菌株がStreptomyces canescensであることが確認された。
3. 発酵および抽出： 最適化された発酵培地で菌株を培養した。粗抽出物はエチルアセテートを用いて取得した。特定の化合物を単離するため、粗抽出物をn-ヘキサン、ジクロロメタン（DCM）、および含水メタノール画分への液液抽出（LLE）分配に供した。
4. 生物活性スクリーニング：
   • 抗菌活性： Staphylococcus aureus、Micrococcus luteus、Escherichia coli、およびPseudomonas aeruginosaに対する最小発育阻止濃度（MIC）測定を実施した。
   • 細胞毒性： ヒト大腸腺癌細胞株（HT29）に対する細胞毒性を評価するために、MTT還元法を用いた。
5. 構造決定： 生理活性を持つDCM画分を半分取HPLCに供した。6つの化合物が単離され、LC-ESI-MSおよび広範な1Dおよび2D NMR分光法（1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC）を用いて特性評価が行われた。
6. 計算科学的研究：
   • 分子ドッキング： 単離されたDKPを細菌標的（DNAジャイレースA、DNAジャイレースB、ジヒドロ葉酸還元酵素［DHFR］）およびがん関連標的（β-チューブリン）に対してドッキングさせ、結合親和性と相互作用モードを予測した。
   • 分子動力学（MD）シミュレーション： 最も優れた性能を示した化合物（化合物5）と、DHFRおよびβ-チューブリンとの間の構造的安定性と相互作用の持続性を評価するため、100ナノ秒のMDシミュレーションを実施し、標準的な抗生物質であるストレプトマイシンと比較した。

主要な貢献および結果

• 新規生物活性代謝物の単離： 本研究では、S. canescens AHL19のDCM画分から、6種類のプロリンベースの2,5-ジケトピペラジン（DKP）を単離・同定することに成功した：

  1. Cyclo (L-Pro-L-Val)
  2. Cyclo (L-Pro-L-Ile)
  3. Cyclo (L-Pro-L-Leu)
  4. Cyclo (L-Pro-L-Phe)
  5. Cyclo (L-Pro-L-Tyr)
  6. Cyclo (4-hydroxy-L-Pro-L-Phe)
     これは、H. caeruleaに関連するStreptomycesからこれらの特定のDKPが報告された初めての事例である。

• 抗菌活性： エチルアセテート粗抽出物は、グラム陽性およびグラム陰性病原体に対して64〜256 µg/mLの範囲のMIC値を示し、広域スペクトルの抗菌活性を示した。単離されたDKPを含むDCM画分は、その強力な細胞毒性に基づき、さらなる研究のために選択された。

• 細胞毒性： DCM画分は、HT29細胞に対してIC50値4.0 ± 0.7 µg/mLという強力な細胞毒性を示した。含水メタノール画分はさらに高い活性（IC50 1.9 ± 0.3 µg/mL）を示したが、化学的プロファイルに基づき、化合物単離にはDCM画分が優先された。

• 計算科学的知見：

  • 標的の選択： 分子ドッキングの結果、単離されたDKPはDNAジャイレースAまたはBに対して有意な結合親和性を示さなかった。しかし、DHFRおよびβ-チューブリンに対して有望な相互作用を示した。
  • 化合物5の優位性： Cyclo (L-Pro-L-Tyr)（化合物5）は、テストされた化合物の中で最も高い結合親和性を示した。DHFRに対しては-8.108 kcal/mol、β-チューブリンに対しては-9.599 kcal/molのドッキングスコアを達成し、DHFRのアッセイにおいてストレプトマイシンを上回った。
  • 水酸基の役割： 化合物5のフェニル環上の水酸基の存在が、結合強化に極めて重要であり、Thr122（DHFR内）およびGln134（β-チューブリン内）の残基との追加の水素結合形成に寄与していることが特定された。
  • MDシミュレーションによる安定性： MDシミュレーションにより、化合物5-DHFR複合体は、100ナノ秒のトラジェトリにおいて、ストレプトマイシン-DHFR複合体と比較して、より高い構造的安定性（低いRMSD変動）およびより持続的な主要相互作用を示すことが確認された。同様の安定性が、化合物5-β-チューブリン複合体でも観察された。

意義および主張
著者らは、本研究を、海綿動物Haliclona caeruleaに関連するStreptomyces canescensから単離されたプロリンベースのDKPに関する最初の報告であると主張している。本研究は、創薬のための持続可能な資源としての海洋共生体の未利用の生物多様性を強調している。

本論文は、これらのプロリンベースのDKPは、その配座の剛性と変化する程度の抗菌および細胞毒性効果により、有望なドラッグリードであると断じている。特に、化合物5は、細菌のDHFRおよびがん関連のβ-チューブリンを効果的に標的とする能力を持つ、強力な天然化合物として強調されている。本研究は、これらの知見が、抗生物質耐性および腫瘍性疾患に対処するための海洋微生物生態系の潜在的な有用性を支持しており、これらの環状ジペプチドのメカニズム、半合成、および臨床応用へのさらなる調査への道を開くものであると結論付けている。