Cytotoxic and antibacterial diketopiperazine cyclic dipeptides from Streptomyces canescens associated with marine sponge Haliclona caerulea

Technische Samenvatting: Cytotoxische en antibacteriële diketopiperazine cyclische dipeptiden van Streptomyces canescens

Probleemstelling
De groeiende wereldwijde dreiging van antibioticaresistentie en de dringende behoefte aan duurzame bronnen van nieuwe bioactieve verbindingen hebben de exploratie van mariene microbiële ecosystemen gestimuleerd. Mariene sponsen, met name die van het geslacht Haliclona, staan bekend om het herbergen van diverse bacteriële gemeenschappen, waaronder Streptomyces-soorten, die dienen als productieve producenten van secundaire metabolieten. Hoewel Haliclona-sponzen diverse alkaloïden hebben opgeleverd, blijven proline-gebaseerde 2,5-diketopiperazines (DKP's) afgeleid specifiek van Streptomyces-symbioten van Haliclona caerulea onderbelicht. Deze studie adresseert de kenniskloof met betrekking tot de chemische diversiteit en bioactiviteit van DKP's uit deze specifieke mariene symbiotische relatie, met als doel potentiële leads te identificeren voor antibacteriële en anticancer therapieën.

Methodologie
Het onderzoek maakte gebruik van een multidisciplinaire aanpak waarbij microbiologie, natuurproductchemie en computationele biologie werden gecombineerd:

1. Monsterverzameling en Isolatie: De mariene spons Haliclona caerulea werd verzameld van Larak Island, Perzische Golf. Geassocieerde bacteriën werden geïsoleerd met behulp van standaard microbiologische technieken op starch-yeast extract peptone agar (SYPA) en marine sponge agar (MSA).
2. Stamidentificatie: De meest potente isolaat, aangeduid als AHL19, werd gekarakteriseerd door middel van morfologische, biochemische en fysiologische tests. Moleculaire identificatie werd bevestigd via 16S rRNA gen-sequencing en fylogenetische analyse, waarmee de stam werd geïdentificeerd als Streptomyces canescens.
3. Fermentatie en Extractie: De stam werd gekweekt in geoptimaliseerde fermentatiemedia. Ruwe extracten werden verkregen met ethylacetaat. Om specifieke verbindingen te isoleren, onderging het ruwe extract een vloeistof-vloeistof extractie (LLE) partiëring in n-hexaan, dichloormethaan (DCM) en waterige methanolfracties.
4. Bioactiviteitsscreening:
   • Antibacterieel: Minimum Inhibitory Concentration (MIC) assays werden uitgevoerd tegen Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Escherichia coli en Pseudomonas aeruginosa.
   • Cytotoxiciteit: De MTT-reductie assay werd gebruikt om de cytotoxiciteit tegen de humane colorectale adenocarcinoom cellijn (HT29) te evalueren.
5. Structurele Elucidatie: De bioactieve DCM-fractie werd onderworpen aan semi-preparatieve HPLC. Zes verbindingen werden geïsoleerd en gekarakteriseerd met behulp van LC-ESI-MS en uitgebreide 1D en 2D NMR-spectroscopie (1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC).
6. Computationele Studies:
   • Moleculaire Docking: De geïsoleerde DKP's werden gedockt tegen bacteriële targets (DNA-gyrase A, DNA-gyrase B, Dihydrofolaat reductase [DHFR]) en een kankergerelateerd target (β-tubuline) om bindingsaffiniteiten en interactiemodi te voorspellen.
   • Moleculaire Dynamica (MD) Simulatie: 100-ns MD-simulaties werden uitgevoerd om de structurele stabiliteit en de persistentie van de interactie van de best presterende verbinding (Verbinding 5) met DHFR en β-tubuline te beoordelen, waarbij deze werd vergeleken met het standaardantibioticum streptomycin.

Belangrijkste Bijdragen en Resultaten

• Isolatie van Nieuwe Bioactieve Metabolieten: De studie slaagde erin zes proline-gebaseerde 2,5-diketopiperazines (DKP's) te isoleren en te karakteriseren uit de DCM-fractie van S. canescens AHL19:

  1. Cyclo (L-Pro-L-Val)
  2. Cyclo (L-Pro-L-Ile)
  3. Cyclo (L-Pro-L-Leu)
  4. Cyclo (L-Pro-L-Phe)
  5. Cyclo (L-Pro-L-Tyr)
  6. Cyclo (4-hydroxy-L-Pro-L-Phe)
     Dit vormt de eerste rapportage van deze specifieke DKP's van H. caerulea-geassocieerde Streptomyces.

• Antibacteriële Activiteit: Het ethylacetaat ruwe extract vertoonde breedspectrum antibacteriële activiteit met MIC-waarden variërend van 64 tot 256 µg/mL tegen Gram-positieve en Gram-negatieve pathogenen. De DCM-fractie, die de geïsoleerde DKP's bevat, werd geselecteerd voor verdere studie vanwege de potente cytotoxiciteit.

• Cytotoxiciteit: De DCM-fractie vertoonde potente cytotoxiciteit tegen HT29-cellen met een IC50-waarde van 4,0 ± 0,7 µg/mL. De waterige methanolfractie vertoonde een nog hogere potentie (IC50 1,9 ± 0,3 µg/mL), hoewel de DCM-fractie de voorkeur kreeg voor compoundisolatie op basis van het chemische profiel.

• Computationele Inzichten:

  • Target Selectie: Moleculaire docking onthulde dat de geïsoleerde DKP's geen significante bindingsaffiniteit vertoonden voor DNA-gyrase A of B. Ze vertoonden echter veelbelovende interacties met DHFR en β-tubuline.
  • Superioriteit van Verbinding 5: Cyclo (L-Pro-L-Tyr) (Verbinding 5) vertoonde de hoogste bindingsaffiniteit onder de geteste verbindingen. Het bereikte een docking score van -8,108 kcal/mol tegen DHFR en -9,599 kcal/mol tegen β-tubuline, waarmee het streptomycin overtrof in de DHFR-assay.
  • Rol van Hydroxylgroepen: De aanwezigheid van een hydroxylgroep op de fenylring van Verbinding 5 werd geïdentificeerd als cruciaal voor verbeterde binding, waarbij extra waterstofbruggen worden gevormd met residuen Thr122 (in DHFR) en Gln134 (in β-tubuline).
  • MD-Simulatie Stabiliteit: MD-simulaties bevestigden dat het Verbinding 5-DHFR complex een grotere structurele stabiliteit (lagere RMSD-fluctuaties) en meer persistente sleutelinteracties vertoonde vergeleken met het streptomycin-DHFR complex over een 100-ns traject. Vergelijkbare stabiliteit werd waargenomen voor het Verbinding 5-β-tubuline complex.

Betekenis en Claims
De auteurs claimen dat deze studie de eerste rapportage is van proline-gebaseerde DKP's geïsoleerd uit Streptomyces canescens geassocieerd met de mariene spons Haliclona caerulea. Het onderzoek benadrukt de onbenutte biodiversiteit van mariene symbionten als een duurzame bron voor drug discovery.

Het artikel stelt dat deze proline-gebaseerde DKP's, gekenmerkt door hun conformationele rigiditeit en variërende graden van antibacteriële en cytotoxische effecten, veelbelovende drug leads zijn. Met name Verbinding 5 wordt uitgelicht als een potent natuurlijk bestanddeel dat effectief kan targeten op bacteriële DHFR en kanker-gerelateerd β-tubuline. De studie concludeert dat deze bevindingen de potentie van mariene microbiële ecosystemen ondersteunen bij het aanpakken van antibioticaresistentie en neoplasmatische ziekten, wat de weg vrijmaakt voor verdere onderzoeken naar de mechanismen, semisynthese en klinische toepassingen van deze cyclische dipeptiden.