Cytotoxic and antibacterial diketopiperazine cyclic dipeptides from Streptomyces canescens associated with marine sponge Haliclona caerulea

技术摘要：来自 Streptomyces canescens 的细胞毒性及抗菌性二酮哌嗪类环二肽

问题陈述
全球范围内抗生素耐药性的上升以及对可持续新型生物活性化合物来源的紧迫需求，驱动了对海洋微生物生态系统的探索。海绵（特别是 Haliclona 属）是已知的多样化细菌群落的宿主，其中包括作为大量次级代谢产物产生者的链阳生菌属（Streptomyces）物种。虽然 Haliclona 海绵已产出多种生物碱，但专门源自 Haliclona caerulea 共生体中链阳生菌的脯氨酸基 2,5-二酮哌嗪（DKPs）仍有待深入研究。本研究旨在解决关于这一特定海洋共生关系中 DKPs 的化学多样性和生物活性的知识空白，旨在为抗菌和抗癌疗法寻找潜在的先导化合物。

研究方法
本研究采用结合了微生物学、天然产物化学和计算生物学的多学科方法：

1. 样本采集与分离： 从拉拉克岛（Larak Island）波斯湾采集海洋海绵 Haliclona caerulea。利用标准微生物技术在淀粉酵母提取物蛋白琼脂（SYPA）和海洋海绵琼脂（MSA）上分离相关细菌。
2. 菌株鉴定： 通过形态学、生化和生理学测试对最具效力的分离株（命名为 AHL19）进行表征。通过 16S rRNA 基因测序和系统发育分析进行分子鉴定，将其确定为链阳生菌 (Streptomyces canescens)。
3. 发酵与提取： 在优化的发酵培养基中培养该菌株。使用乙酸乙酯获取粗提取物。为了分离特定化合物，粗提取物经过液-液萃取（LLE）分配，分为正己烷、二氯甲烷（DCM）和甲醇水溶液组分。
4. 生物活性筛选：
   • 抗菌活性： 对金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、微球菌 (Micrococcus luteus)、大肠杆菌 (Escherichia coli) 和铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) 进行最低抑菌浓度（MIC）测定。
   • 细胞毒性： 使用 MTT 还原实验评估其对人类结直肠腺癌细胞系（HT29）的细胞毒性。
5. 结构解析： 对具有生物活性的 DCM 组分进行半制备 HPLC 分离。分离出六种化合物，并利用 LC-ESI-MS 以及广泛的一维和二维 NMR 光谱（1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC）进行表征。
6. 计算研究：
   • 分子对接： 将分离出的 DKPs 与细菌靶点（DNA 旋转酶 A、DNA 旋转酶 B、二氢叶酸还原酶 [DHFR]）以及癌症相关靶点（β-微管蛋白）进行对接，以预测结合亲和力和相互作用模式。
   • 分子动力学（MD）模拟： 进行 100 ns 的 MD 模拟，以评估表现最佳的化合物（化合物 5）与 DHFR 和 β-微管蛋白的结构稳定性和相互作用持久性，并将其与标准抗生素链霉素进行对比。

核心贡献与结果

• 分离出新型生物活性代谢物： 本研究成功从 S. canescens AHL19 的 DCM 组分中分离并表征了六种脯氨酸基 2,5-二酮哌嗪（DKPs）：

  1. Cyclo (L-Pro-L-Val)
  2. Cyclo (L-Pro-L-Ile)
  3. Cyclo (L-Pro-L-Leu)
  4. Cyclo (L-Pro-L-Phe)
  5. Cyclo (L-Pro-L-Tyr)
  6. Cyclo (4-hydroxy-L-Pro-L-Phe)
     这是首次报道这些特定的 DKPs 来源于与 H. caerulea 共生的链阳生菌。

• 抗菌活性： 乙酸乙酯粗提取物对革兰氏阳性及革兰氏阴性病原体表现出广谱抗菌活性，MIC 值范围为 64 至 256 µg/mL。由于含有分离出的 DKPs，DCM 组分因其显著的细胞毒性而被选作进一步研究的对象。

• 细胞毒性： DCM 组分对 HT29 细胞表现出强效的细胞毒性，IC50 值为 4.0 ± 0.7 µg/mL。甲醇水溶液组分显示出更高的效力（IC50 为 1.9 ± 0.3 µg/mL），但基于其化学特征，DCM 组分被优先用于化合物分离。

• 计算学见解：

  • 靶点选择： 分子对接显示，分离出的 DKPs 对 DNA 旋转酶 A 或 B 没有表现出显著的结合亲和力。然而，它们对 DHFR 和 β-微管蛋白表现出极具前景的相互作用。
  • 化合物 5 的优越性： 在所有测试的化合物中，Cyclo (L-Pro-L-Tyr)（化合物 5）表现出最高的结合亲和力。它在 DHFR 中的对接得分达到 -8.108 kcal/mol，在 β-微管蛋白中的对接得分达到 -9.599 kcal/mol，在 DHFR 实验中优于链霉素。
  • 羟基的作用： 研究发现，化合物 5 苯环上的羟基对于增强结合至关重要，它能与 Thr122（在 DHFR 中）和 Gln134（在 β-微管蛋白中）形成额外的氢键。
  • MD 模拟稳定性： MD 模拟证实，与链霉素-DHFR 复合物相比，化合物 5-DHFR 复合物在 100 ns 的轨迹中表现出更高的结构稳定性（较低的 RMSD 波动）和更持久的关键相互作用。在化合物 5-β-微管蛋白复合物中也观察到了类似的稳定性。

意义与主张
作者声称，本研究是首次报道从与海洋海绵 Haliclona caerulea 相关的链阳生菌 (Streptomyces canescens) 中分离出脯氨酸基 DKPs。该研究强调了海洋共生生物作为药物发现的可持续来源所蕴含的未开发生物多样性。

本文认为，这些具有构象刚性和不同程度抗菌及细胞毒性效应的脯氨酸基 DKPs 是极具前景的药物先导化合物。特别是，化合物 5 被强调为一种能够有效靶向细菌 DHFR 和癌症相关 β-微管蛋白的强效天然化合物。研究结论指出，这些发现支持了海洋微生物生态系统在应对抗生素耐药性和肿瘤性疾病方面的潜力，为进一步研究这些环二肽的机制、半合成及临床应用铺平了道路。