Cytotoxic and antibacterial diketopiperazine cyclic dipeptides from Streptomyces canescens associated with marine sponge Haliclona caerulea

Technische Zusammenfassung: Zytotoxische und antibakterielle Diketopiperazin-Cyclodipeptide aus Streptomyces canescens

Problemstellung
Die weltweit steigende Bedrohung durch Antibiotikaresistenzen und die dringende Notwendigkeit nachhaltiger Quellen für neuartige bioaktive Verbindungen haben die Erforschung mariner mikrobieller Ökosysteme vorangetrieben. Marine Schwämme, insbesondere der Gattung Haliclona, sind dafür bekannt, vielfältige bakterielle Gemeinschaften zu beherbergen, einschließlich Streptomyces-Arten, die als ergiebige Produzenten von Sekundärmetaboliten dienen. Während Haliclona-Schwämme verschiedene Alkaloide geliefert haben, bleiben Prolin-basierte 2,5-Diketopiperazine (DKPs), die spezifisch aus den Streptomyces-Symbionten von Haliclona caerulea stammen, untererforscht. Diese Studie adressiert die Wissenslücke hinsichtlich der chemischen Diversität und Bioaktivität von DKPs aus dieser spezifischen marinen symbiotischen Beziehung mit dem Ziel, potenzielle Leitstrukturen für antibakterielle und anticancer-Therapien zu identifizieren.

Methodik
Die Forschung verwendete einen multidisziplinären Ansatz, der Mikrobiologie, Naturstoffchemie und Computerbiologie kombinierte:

1. Probenentnahme und Isolierung: Der marine Schwamm Haliclosa caerulea wurde von der Larak-Insel im Persischen Golf gesammelt. Die assoziierten Bakterien wurden mittels standardisierter mikrobiologischer Techniken auf Stärke-Hefe-Extrakt-Pepton-Agar (SYPA) und Meereschwamm-Agar (MSA) isoliert.
2. Stammidentifizierung: Der potenteste Isolat, bezeichnet als AHL19, wurde durch morphologische, biochemische und physiologische Tests charakterisiert. Die molekulare Identifizierung wurde mittels 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung und phylogenetischer Analyse bestätigt, wobei der Stamm als Streptomyces canescens identifiziert wurde.
3. Fermentation und Extraktion: Der Stamm wurde in optimierten Fermentationsmedien kultiviert. Rohextrakte wurden mittels Ethylacetat gewonnen. Zur Isolierung spezifischer Verbindungen wurde der Rohextrakt einer Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE) unterzogen, die in n-Hexan-, Dichlormethan (DCM)- und wässrige Methanol-Fraktionen aufgeteilt wurde.
4. Bioaktivitäts-Screening:
   • Antibakteriell: Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) erfolgte gegen Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa.
   • Zytotoxizität: Der MTT-Reduktionsassay wurde verwendet, um die Zytotoxizität gegenüber der menschlichen Kolorektum-Adenokarzinom-Zelllinie (HT29) zu bewerten.
5. Strukturaufklärung: Die bioaktive DCM-Fraktion wurde einer semipräparativen HPLC unterzogen. Sechs Verbindungen wurden isoliert und mittels LC-ESI-MS sowie umfangreicher 1D- und 2D-NMR-Spektroskopie (1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC) charakterisiert.
6. Computergestützte Studien:
   • Molekulares Docking: Die isolierten DKPs wurden gegen bakterielle Targets (DNA-Gyrase A, DNA-Gyrase B, Dihydrofolat-Reduktase [DHFR]) und ein krebsrelevantes Target (β-Tubulin) gedockt, um Bindungsaffinitäten und Interaktionsmodi vorherzusagen.
   • Molekulardynamik (MD)-Simulation: Es wurden 100-ns-MD-Simulationen durchgeführt, um die strukturelle Stabilität und die Beständigkeit der Interaktionen der leistungsfähigsten Verbindung (Verbindung 5) mit DHFR und β-Tubulin zu bewerten, wobei diese mit dem Standardantibiotikum Streptomycin verglichen wurde.

Wesentliche Beiträge und Ergebnisse

• Isolierung neuartiger bioaktiver Metaboliten: Die Studie isolierte und charakterisierte erfolgreich sechs Prolin-basierte 2,5-Diketopiperazine (DKPs) aus der DCM-Fraktion von S. canescens AHL19:

  1. Cyclo (L-Pro-L-Val)
  2. Cyclo (L-Pro-L-Ile)
  3. Cyclo (L-Pro-L-Leu)
  4. Cyclo (L-Pro-L-Phe)
  5. Cyclo (L-Pro-L-Tyr)
  6. Cyclo (4-Hydroxy-L-Pro-L-Phe)
     Dies stellt den ersten Bericht über diese spezifischen DKPs aus H. caerulea-assoziierten Streptomyces dar.

• Antibakterielle Aktivität: Der Ethylacetat-Rohextrakt zeigte eine Breitband-Antibakterielle Aktivität mit MHK-Werten zwischen 64 und 256 µg/mL gegen grampositive und gramnegative Pathogene. Die DCM-Fraktion, die die isolierten DKPs enthielt, wurde aufgrund ihrer potenten Zytotoxizität für die weitere Untersuchung ausgewählt.

• Zytotoxizität: Die DCM-Fraktion wies eine potente Zytotoxizität gegenüber HT29-Zellen mit einem IC50-Wert von 4,0 ± 0,7 µg/mL auf. Die wässrige Methanol-Fraktion zeigte eine noch höhere Potenz (IC50 1,9 ± 0,3 µg/mL), wobei die DCM-Fraktion basierend auf ihrem chemischen Profil für die Isolierung von Verbindungen priorisiert wurde.

• Computergestützte Erkenntnisse:

  • Target-Selektion: Das molekulare Docking ergab, dass die isolierten DKPs keine signifikante Bindungsaffinität für DNA-Gyrase A oder B zeigten. Sie zeigten jedoch vielversprechende Interaktionen mit DHFR und β-Tubulin.
  • Überlegenheit von Verbindung 5: Cyclo (L-Pro-L-Tyr) (Verbindung 5) wies die höchste Bindungsaffinität unter den getesteten Verbindungen auf. Sie erreichte einen Docking-Score von -8,108 kcal/mol gegen DHFR und -9,599 kcal/mol gegen β-Tubulin und übertraf damit Streptomycin im DHFR-Assay.
  • Rolle der Hydroxylgruppen: Die Anwesenheit einer Hydroxylgruppe am Phenylring von Verbindung 5 wurde als entscheidend für die verbesserte Bindung identifiziert, da sie zusätzliche Wasserstoffbrückenbindungen mit den Resten Thr122 (in DHFR) und Gln134 (in β-Tubulin) bildet.
  • Stabilität der MD-Simulation: MD-Simulationen bestätigten, dass der Verbindung 5-DHFR-Komplex eine größere strukturelle Stabilität (geringere RMSD-Fluktuationen) und beständigere Schlüsselinteraktionen im Vergleich zum Streptomycin-DHFR-Komplex über eine 100-ns-Trajektorie aufwies. Eine ähnliche Stabilität wurde beim Verbindung 5-β-Tubulin-Komplex beobachtet.

Bedeutung und Ansprüche
Die Autoren beanspruchen für diese Studie den ersten Bericht über Prolin-basierte DKPs, die aus Streptomyces canescens im Zusammenhang mit dem marinen Schwamm Haliclona caerulea isoliert wurden. Die Forschung unterstreicht die unerschlossene Biodiversität mariner Symbionten als nachhaltige Quelle für die Wirkstoffforschung.

Die Arbeit postuliert, dass diese Prolin-basierten DKPs, die sich durch ihre konformative Rigidität und variierende Grade an antibakterieller und zytotoxischer Wirkung auszeichnen, vielversprechende Wirkstoffleitstrukturen sind. Insbesondere wird Verbindung 5 als potenter Naturstoff hervorgehoben, der in der Lage ist, effektiv bakterielles DHFR und krebsrelevantes β-Tubulin zu targetieren. Die Studie kommt zu dem Schluss, dass diese Ergebnisse die potenzielle Bedeutung mariner mikrobieller Ökosysteme bei der Bewältigung von Antibiotikaresistenzen und neoplastischen Erkrankungen unterstützen und den Weg für weitere Untersuchungen der Mechanismen, der Semisynthese und der klinischen Anwendungen dieser cyclischen Dipeptide ebnen.