Cytotoxic and antibacterial diketopiperazine cyclic dipeptides from Streptomyces canescens associated with marine sponge Haliclona caerulea

Resumen Técnico: Diketopiperazinas Cíclicas de Dicetopéptidos Citotóxicos y Antibacterianos de Streptomyces canescens

Planteamiento del Problema
La creciente amenaza global de la resistencia a los antibióticos y la necesidad urgente de fuentes sostenibles de nuevos compuestos bioactivos han impulsado la exploración de los ecosistemas microbianos marinos. Las esponjas marinas, particularmente las del género Haliclona, son conocidas por albergar diversas comunidades bacterianas, incluyendo especies de Streptomyces, que actúan como productoras prolíficas de metabolitos secundarios. Mientras que las esponjas Haliclona han rendido diversos alcaloides, las 2,5-dicetopiperazinas (DKP) basadas en prolina derivadas específicamente de simbiontes de Streptomyces de Haliclona caerulea permanecen poco exploradas. Este estudio aborda la brecha de conocimiento respecto a la diversidad química y la bioactividad de las DKP de esta relación simbiótica marina específica, con el objetivo de identificar posibles candidatos para terapias antibacterianas y anticancerígenas.

Metodología
La investigación empleó un enfoque multidisciplinario que combinó microbiología, química de productos naturales y biología computacional:

1. Recolección y Aislamiento de Muestras: La esponja marina Haliclona caerulea fue recolectada en la isla de Larak, en el Golfo Pérsico. Las bacterias asociadas fueron aisladas utilizando técnicas microbiológicas estándar en agar de almidón-extracto de levina (SYPA) y agar de esponja marina (MSA).
2. Identificación de la Cepa: El aislado más potente, designado como AHL19, fue caracterizado mediante pruebas morfológicas, bioquímicas y fisiológicas. La identificación molecular se confirmó mediante la secuenciación del gen ARNr 16S y análisis filogenético, identificando la cepa como Streptomyces canescens.
3. Fermentación y Extracción: La cepa fue cultivada en medios de fermentación optimizados. Los extractos crudos se obtuvieron mediante acetato de etilo. Para aislar compuestos específicos, el extracto crudo se sometió a una partición de extracción líquido-líquido (LLE) en fracciones de n-hexano, diclorometano (DCM) y metanol acuoso.
4. Tamizaje de Bioactividad:
   • Antibacteriana: Se realizaron ensayos de Concentración Inhibitoria Mínima (MIC) contra Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa.
   • Citotoxicidad: Se utilizó el ensayo de reducción de MTT para evaluar la citotoxicidad contra la línea celular de adenocarcinoma de colon humano (HT29).
5. Elucidación Estructural: La fracción de DCM bioactiva fue sometida a HPLC semipreparativa. Se aislaron y caracterizaron seis compuestos utilizando LC-ESI-MS y una extensa espectroscopía de RMN 1D y 2D (1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC).
6. Estudios Computacionales:
   • Acoplamiento Molecular (Molecular Docking): Las DKP aisladas se acoplaron contra objetivos bacterianos (ADN girasa A, ADN girasa B, Dihidrofolato reductasa [DHFR]) y un objetivo relacionado con el cáncer (β-tubulina) para predecir afinidades de unión y modos de interacción.
   • Simulación de Dinámica Molecular (MD): Se realizaron simulaciones de MD de 100 ns para evaluar la estabilidad estructural y la persistencia de la interacción del compuesto superior (Compuesto 5) con DHFR y β-tubulina, comparándolo con el antibiótico estándar estreptomicina.

Contribuciones Clave y Resultados

• Aislamiento de Metabolitos Bioactivos Novedosos: El estudio aisló y caracterizó con éxito seis 2,5-dicetopiperazinas (DKP) basadas en prolina de la fracción de DCM de S. canescens AHL19:

  1. Ciclo (L-Pro-L-Val)
  2. Ciclo (L-Pro-L-Ile)
  3. Ciclo (L-Pro-L-Leu)
  4. Ciclo (L-Pro-L-Phe)
  5. Ciclo (L-Pro-L-Tyr)
  6. Ciclo (4-hidroxi-L-Pro-L-Phe)
     Esto representa el primer reporte de estas DKP específicas de Streptomyces asociados a H. caerulea.

• Actividad Antibacteriana: El extracto crudo de acetato de etilo demostró una actividad antibacteriana de amplio espectro con valores de MIC que oscilaron entre 64 y 256 µg/mL contra patógenos Gram-positivos y Gram-negativos. La fracción de DCM, que contiene las DKP aisladas, fue seleccionada para estudios posteriores debido a su potente citotoxicidad.

• Citotoxicidad: La fracción de DCM exhibió una potente citotoxicidad contra células HT29 con un valor de IC50 de 4.0 ± 0.7 µg/mL. La fracción de metanol acuoso mostró una potencia aún mayor (IC50 1.9 ± 0.3 µg/mL), aunque la fracción de DCM fue priorizada para el aislamiento de compuestos basándose en su perfil químico.

• Perspectivas Computacionales:

  • Selección de Objetivos: El acoplamiento molecular reveló que las DKP aisladas no mostraron una afinidad de unión significativa para la ADN girasa A o B. Sin embargo, mostraron interacciones prometedoras con DHFR y β-tubulina.
  • Superioridad del Compuesto 5: Ciclo (L-Pro-L-Tyr) (Compuesto 5) demostró la mayor afinidad de unión entre los compuestos probados. Alcanzó una puntuación de acoplamiento de -8.108 kcal/mol contra DHFR y -9.599 kcal/mol contra β-tubulina, superando a la estreptomicina en el ensayo de DHFR.
  • Rol de los Grupos Hidroxilo: Se identificó que la presencia de un grupo hidroxilo en el anillo de fenilo del Compuesto 5 es crítica para mejorar la unión, formando enlaces de hidrógeno adicionales con los residuos Thr122 (en DHFR) y Gln134 (en β-tubulina).
  • Estabilidad de la Simulación de MD: Las simulaciones de MD confirmaron que el complejo Compuesto 5-DHFR exhibió una mayor estabilidad estructural (menores fluctuaciones de RMSD) e interacciones clave más persistentes en comparación con el complejo estreptomicina-DHFR durante una trayectoria de 100 ns. Se observó una estabilidad similar para el complejo Compuesto 5-β-tubulina.

Significancia y Reivindicaciones
Los autores reivindican este estudio como el primer reporte de DKP basadas en prolina aisladas de Streptomyces canescens asociado con la esponja marina Haliclona caerulea. La investigación subraya la biodiversidad inexplotada de los simbiontes marinos como una fuente sostenible para el descubrimiento de fármacos.

El artículo postula que estas DKP basadas en prolina, caracterizadas por su rigidez conformacional y sus variados grados de efectos antibacterianos y citotóxicos, son candidatos a fármacos prometedores. Específicamente, el Compuesto 5 se destaca como un compuesto natural potente capaz de atacar eficazmente la DHFR bacteriana y la β-tubulina relacionada con el cáncer. El estudio concluye que estos hallazgos respaldan el potencial de los ecosistemas microbianos marinos para abordar la resistencia antibacteriana y las enfermedades neoplásicas, allanando el camino para futuras investigaciones sobre sus mecanismos, semisíntesis y aplicaciones clínicas de estos dipeptidos cíclicos.