Cytotoxic and antibacterial diketopiperazine cyclic dipeptides from Streptomyces canescens associated with marine sponge Haliclona caerulea

Resumo Técnico: Diketopiperazinas Cíclicas de Natureza Citotóxica e Antibacteriana de Streptomyces canescens

Definição do Problema
A crescente ameaça global da resistência antibiótica e a necessidade urgente de fontes sustentáveis de novos compostos bioativos têm impulsionado a exploração de ecossistemas microbianos marinhos. Esponjas marinhas, particularmente as do gênero Haliclona, são conhecidas por abrigar diversas comunidades bacterianas, incluindo espécies de Streptomyces, que servem como produtores prolíficos de metabólitos secundários. Embora as esponjas Haliclona tenham rendido vários alcaloides, as 2,5-diketopiperazinas (DKPs) baseadas em prolina derivadas especificamente de simbiontes Streptomyces de Haliclona caerulea permanecem subexploradas. Este estudo aborda a lacuna no conhecimento sobre a diversidade química e a bioatividade das DKPs deste relacionamento simbiótico marinho específico, visando identificar potenciais candidatos para terapias antibacterianas e anticancerígenas.

Metodologia
A pesquisa empregou uma abordagem multidisciplinar combinando microbiologia, química de produtos naturais e biologia computacional:

1. Coleta e Isolamento de Amostras: A esponja marinha Haliclona caerulea foi coletada na Ilha de Larak, no Golfo Pérsico. As bactérias associadas foram isoladas utilizando técnicas microbiológicas padrão em ágar de amido-levedura-peptona (SYPA) e ágar de esponja marinha (MSA).
2. Identificação da Cepa: O isolado mais potente, designado AHL19, foi caracterizado através de testes morfológicos, bioquímicos e fisiológicos. A identificação molecular foi confirmada via sequenciamento do gene 16S rRNA e análise filogenética, identificando a cepa como Streptomyces canescens.
3. Fermentação e Extração: A cepa foi cultivada em meios de fermentação otimizados. Os extratos crus foram obtidos utilizando acetato de etila. Para isolar compostos específicos, o extrato bruto passou por partição de extração líquido-líquido (LLE) em frações de n-hexano, diclorometano (DCM) e metanol aquoso.
4. Triagem de Bioatividade:
   • Antibacteriana: Ensaios de Concentração Inibitória Mínima (MIC) foram realizados contra Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa.
   • Citotoxicidade: O ensaio de redução de MTT foi utilizado para avaliar a citotoxicidade contra a linhagem de células de adenocarcinoma colorretal humano (HT29).
5. Elucidação Estrutural: A fração bioativa de DCM foi submetida à HPLC semipreparativa. Seis compostos foram isolados e caracterizados usando LC-ESI-MS e extensa espectroscopia de RMN 1D e 2D (1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC).
6. Estudos Computacionais:
   • Docking Molecular: As DKPs isoladas foram submetidas a docking contra alvos bacterianos (DNA girase A, DNA girase B, Dihidrofolato redutase [DHFR]) e um alvo relacionado ao câncer (β-tubulina) para prever afinidades de ligação e modos de interação.
   • Simulação de Dinâmica Molecular (MD): Simulações de MD de 100 ns foram conduzidas para avaliar a estabilidade estrutural e a persistência da interação do composto de melhor desempenho (Composto 5) com DHFR e β-tubulina, comparando-o com o antibiótico padrão estreptomicina.

Principais Contribuições e Resultados

• Isolamento de Metabólitos Bioativos Inovadores: O estudo isolou e caracterizou com sucesso seis 2,5-diketopiperazinas (DKPs) baseadas em prolina da fração de DCM de S. canescens AHL19:

  1. Cyclo (L-Pro-L-Val)
  2. Cyclo (L-Pro-L-Ile)
  3. Cyclo (L-Pro-L-Leu)
  4. Cyclo (L-Pro-L-Phe)
  5. Cyclo (L-Pro-L-Tyr)
  6. Cyclo (4-hidroxi-L-Pro-L-Phe)
     Este representa o primeiro relato destas DKPs específicas de Streptomyces associados a H. caerulea.

• Atividade Antibacteriana: O extrato bruto de acetato de etila demonstrou atividade antibacteriana de amplo espectro com valores de MIC variando de 64 a 256 µg/mL contra patógenos Gram-positivos e Gram-negativos. A fração de DCM, contendo as DKPs isoladas, foi selecionada para estudo posterior devido à sua potente citotoxicidade.

• Citotoxicidade: A fração de DCM exibiu citotoxicidade potente contra células HT29 com um valor de IC50 de 4,0 ± 0,7 µg/mL. A fração de metanol aquoso mostrou ainda maior potência (IC50 1,9 ± 0,3 µg/mL), embora a fração de DCM tenha sido priorizada para o isolamento de compostos com base em seu perfil químico.

• Insights Computacionais:

  • Seleção de Alvo: O docking molecular revelou que as DKPs isoladas não mostraram afinidade de ligação significativa para a DNA girase A ou B. No entanto, elas mostraram interações promissoras com DHFR e β-tubulina.
  • Superioridade do Composto 5: O Cyclo (L-Pro-L-Tyr) (Composto 5) demonstrou a maior afinidade de ligação entre os compostos testados. Ele alcançou um escore de docking de -8,108 kcal/mol contra DHFR e -9,599 kcal/mol contra β-tubulina, superando a estreptomicina no ensaio de DHFR.
  • Papel dos Grupos Hidroxila: A presença de um grupo hidroxila no anel fenila do Composto 5 foi identificada como crítica para o aumento da ligação, formando ligações de hidrogênio adicionais com os resíduos Thr122 (em DHFR) e Gln134 (em β-tubulina).
  • Estabilidade de Simulação de MD: Simulações de MD confirmaram que o complexo Composto 5-DHFR exibiu maior estabilidade estrutural (menores flutuações de RMSD) e interações fundamentais mais persistentes em comparação com o complexo estreptomicina-DHFR ao longo de uma trajetória de 100 ns. Estabilidade semelhante foi observada para o complexo Composto 5-β-tubulina.

Significância e Alegações
Os autores reivindicam este estudo como o primeiro relato de DKPs baseadas em prolina isoladas de Streptomyces canescens associado à esponja marinha Haliclona caerulea. A pesquisa destaca a biodiversidade inexplorada de simbiontes marinhos como uma fonte sustentável para a descoberta de fármacos.

O artigo postula que estas DKPs baseadas em prolina, caracterizadas por sua rigidez conformacional e graus variáveis de efeitos antibacterianos e citotóxicos, são promessas de fármacos. Especificamente, o Composto 5 é destacado como um composto natural potente capaz de atingir eficazmente a DHFR bacteriana e a β-tubulina relacionada ao câncer. O estudo conclui que estas descobertas apoiam o potencial dos ecossistemas microbianos marinhos para enfrentar a resistência antibacteriana e doenças neoplásicas, abrindo caminho para investigações futuras sobre os mecanismos, semissíntese e aplicações clínicas destes dipeptídeos cíclicos.