Phylogenetic Analysis of cpn60 UT region reveal oligonucleotide regions for the detection of prominent Enterobacteriaceae pathogens

البكتيريا موجودة في كل مكان، وبينما معظمها غير ضارة، تضم عائلة محددة تُعرف باسم "الأمعائيات" (Enterobacteriaceae) العديد من المزعجين المشهورين. تحتوي هذه المجموعة على كائنات مثل "الإشريكية القولونية" (E. coli)، و"السالمونيلا" (Salmonella)، و"الشيجيلا" (Shigella)، والتي يمكن أن تسبب أمراضًا شديدة عندما يستهلك الناس طعامًا أو مياهًا ملوثة. لعقود من الزمن، اعتمد العلماء على تنمية هذه البكتيريا في المختبر لتحديد نوعها، وهي عملية بطيئة، غالبًا ما تستغرق أسبوعًا أو أكثر لتقديم إجابة نهائية. وفي هذه الأثناء، يمكن أن تنتشر حالات التفشي، وينتظر المرضى تلقي العلاج. ولتسريع العملية، لجأ الباحثون إلى أدوات جزيئية تبحث عن البصمات الجينية الفريدة لهذه الغزاة. ومع ذلك، فإن العثور على علامة جينية محددة بما يكفي للإمساك بجميع الأعضاء الخطيرين من هذه العائلة، وفي الوقت نفسه مختلفة بما يكفي لتجاهل البكتيريا غير الضارة، كان تحديًا مستمرًا.

لقد عالج فريق من الباحثين في معهد تقنيات الدفاع البيولوجي في الهند هذه المشكلة من خلال التركيز على جزء محدد من الجينوم البكتيري يسمى جين "cpn60". هذا الجين موجود في معظم البكتيريا ويعمل كمساعد جزيئي، حيث يضمن طي البروتينات في الأشكال الصحيحة لتعمل بشكل سليم. وضمن هذا الجين، يوجد منطقة تُعرف باسم "الهدف العالمي"، وهي امتداد من الحمض النووي (DNA) يتنوع بما يكفي بين الأنواع البكتيرية للتمييز بينها، ولكنه يظل مستقرًا بما يكفي داخل عائلة محددة ليتم التعرف عليها كمجموعة. افترض الباحثون أن هذه المنطقة يمكن أن تكون هدفًا موثوقًا لاختبار سريع يميز "الأمعائيات" الخطيرة عن البكتيريا الأخرى.

لاختبار هذه الفكرة، جمع الفريق أولاً بيانات جينية من 236 تسلسلاً مختلفًا لمنطقة هذا الجين المحدد الموجودة في أنواع مختلفة من مسببات الأمراض من "الأمعائيات". استخدموا برامج حاسوبية لمحاذاة هذه التسلسلات جنبًا إلى جنب، بحثًا عن الأنماط. كشف هذا التحليل أن البكتيريا يمكن تصنيفها إلى 13 مجموعة متميزة بناءً على تركيبها الجيني. وبينما كانت بعض المجموعات متشابهة جدًا مع بعضها البعض، أظهرت مجموعات أخرى اختلافات كبيرة. والأهم من ذلك، وجد الباحثون قطعتين قصيرتين من الحمض النووي ضمن هذه التسلسلات ظلتا ثابتتين بشكل ملحوظ عبر العائلة بأكملها، حتى مع تغير بقية الجين. عملت هذه الامتدادات المستقرة كـ "لغة مشتركة" تشترك فيها جميع البكتيريا المستهدفة، مما جعلها نقاطًا مثالية لتصميم أداة كشف.

باستخدام هذه المناطق المحفوظة، صمم العلماء مجموعة من "البادئات" (primers) الجزيئية. وببساطة، البادئات هي قطع قصيرة من المادة الوراية تعمل كنقاط انطلاق لآلة لنسخ جزء معين من الحمض النووي. ولأن البكتيريا في هذه العائلة ليست متطابقة جميعها، اضطر الباحثون إلى إنشاء "بادئات متدهورة" (degenerate primers). وهذا يعني أن البادئات صُممت بكود مرن يمكنه مطابقة متغيرات متعددة من تسلسل الحمض النووي في نفس الوقت، مما يضمن أن الاختبار سيعمل مع "الإشريكية القولونية"، و"السالمونيلا"، و"الكلبسيلة" (Klebsiella)، وأعضاء آخرين من العائلة، بغضًا عن سلالتهم المحددة. ثم قاموا ببناء مقايسة "تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي" (real-time PCR assay)، وهي تقنية تضاعف الحمض النووي وتضيء بصبغة فلورية إذا كان الهدف موجودًا، مما يسمح بالتأكيد البصري الفوري.

اختبر الفريق مقايستهم الجديدة في المختبر باستخدام مزارع نقية من البكتيريا. وعندما أدخلوا الحمض النووي من "الإشريكية القولونية"، عمل الاختبار بسرعة، حيث اكتشف البكتيريا بعد 13 دورة فقط من التضخيم وأنتج إشارة واضحة. أثبت الاختبار أنه عالي الحساسية، حيث كان قادرًا على اكتشاف عدد ضئيل يصل إلى 10 خلايا بكتيرية في ميليلتر واحد من السائل. والأهم من ذلك، كان الاختبار عالي النوعية. فعندما أجرى الباحثون نفس الاختبار على الحمض النووي لبكتيريا "المكورات العنقودية الذهبية" (Staphylococcus aureus) و"الليستيريا مونوسيتوجينز" (Listeria monocytogenes) — وهما بكتيريتان خطيرتان وليستا من فصيلة "الأمعائيات" — ظل الجهاز صامتًا. لم يتم إنتاج أي إشارة، مما أكد أن البادئات لم تلتصق بالخطأ بالبكتيريا الخاطئة. وقد ثبتت هذه النوعية في جميع سلالات "الأمعائيات" المسببة للأمراض التي اختبرها الباحثون، بما في ذلك أنواع مختلفة من "السالمونيلا" و"الشيجيلا".

يقر الباحثون بأنه بينما يعمل الاختبار بشكل مثالي على المزارع المختبرية النقية، إلا أنه لم يتم التحقق من صحته بعد على عينات واقعية معقدة مثل الأطعمة أو عينات المرضى السريرية. كما أشاروا إلى أن الدراسة استخدمت عددًا محدودًا من السلالات البكتيرية للتحقق. ومع ذلك، فإن النتائج تثبت أن منطقة الهدف العالمي في جين "cpn60" هي علامة قابلة للتطبيق وواعدة لتحديد هذه المجموعة الخطيرة من البكتيريا. ومن خلال تقديم طريقة أسرع من الزراعة التقليدية وأكثر نوعية من الاختبارات الجينية القديمة، يمكن لهذا النهج أن يساعد مختبرات التشخيص في نهاية المطاف على تحديد التهديدات المنقولة بالغذاء والمياه في وقت أقصر بكما، مما قد يساهم في الحد من انتشار العدوى وإنقاذ الأرواح.