Phylogenetic Analysis of cpn60 UT region reveal oligonucleotide regions for the detection of prominent Enterobacteriaceae pathogens

I batteri sono ovunque e, sebbene la maggior parte sia innocua, una famiglia specifica nota come Enterobacteriaceae include diversi notoramente problematici elementi di disturbo. Questo gruppo contiene organismi come E. coli, Salmonella e Shigella, che possono causare gravi malattie quando le persone consumano cibo o acqua contaminati. Per decenni, gli scienziati si sono affidati alla crescita di questi batteri in laboratorio per identificarli, un processo lento che spesso richiede una settimana o più per fornire una risposta definitiva. Nel frattempo, i focolai possono diffondersi e i pazienti attendono il trattamento. Per velocizzare le cose, i ricercatori si sono rivolti a strumenti molecolari che cercano le impronte digitali genetiche uniche di questi invasori. Tuttavia, trovare un marcatore genetico che sia abbastanza specifico da catturare tutti i membri pericolosi di questa famiglia, ma abbastanza diverso da ignorare i batteri innocui, è stata una sfida persistente.

Un team di ricercatori presso l'Istituto di Tecnologie di Biodefesa in India ha affrontato questo problema concentrandosi su una parte specifica del genoma batterico chiamata gene cpn60. Questo gene è presente in quasi tutti i batteri e agisce come un aiutante molecolare, assicurando che le proteine si ripieghino nelle forme corrette per funzionare correttamente. All'interno di questo gene si trova una regione nota come "bersaglio universale", un tratto di DNA che varia abbastanza tra le diverse specie batteriche da distinguerle, ma che rimane sufficientemente stabile all'interno di una specifica famiglia da essere riconosciuto come un gruppo. I ricercatori hanno ipotizzato che questa regione potesse servire come bersaglio affidabile per un test rapido che distingua le pericolose Enterobacteriaceae da altri batteri.

Per testare questa idea, il team ha prima raccolto dati genetici da 236 diverse sequenze di questa specifica regione genica trovata in varie patogene Enterobacteriaceae. Hanno utilizzato un software per allineare queste sequenze fianco a fianco, cercando modelli. Questa analisi ha rivelato che i batteri potevano essere suddivisi in 13 gruppi distinti in base al loro corredo genetico. Mentre alcuni gruppi erano molto simili tra loro, altri mostravano differenze significative. Fondamentalmente, i ricercatori hanno scoperto due brevi tratti di DNA all'interno di queste sequenze che rimanevano straordinariamente coerenti in tutta la famiglia, anche mentre il resto del gene cambiava. Questi tratti stabili agivano come un linguaggio comune condiviso da tutti i batteri bersaglio, rendendoli punti perfetti per progettare uno strumento di rilevamento.

Utilizzando queste regioni conservate, gli scienziati hanno progettato un set di primer molecolari. In termini semplici, i primer sono brevi pezzi di materiale genetico che fungono da punti di partenza per una macchina per copiare un segmento specifico di DNA. Poiché i batteri di questa famiglia non sono tutti identici, i ricercatori hanno dovuto creare primer "degenerati". Ciò significa che i primer sono stati progettati con un codice flessibile che potesse corrispondere a più variazioni della sequenza di DNA contemporaneamente, garantendo che il test funzionasse per E. coli, Salmonella, Klebsiella e altri membri della famiglia, indipendentemente dal loro ceppo specifico. Hanno poi costruito un saggio PCR in tempo reale, una tecnica che amplifica il DNA e si illumina con un colorante fluorescente se il bersaglio è presente, consentendo una conferma visiva immediata.

Il team ha testato il loro nuovo saggio in laboratorio utilizzando colture pure di batteri. Quando hanno introdotto il DNA di E. coli, il test ha funzionato rapidamente, rilevando i batteri dopo soli 13 cicli di amplificazione e producendo un segnale chiaro. Il test si è dimostrato altamente sensibile, capace di rilevare anche solo 10 cellule batteriche in un millilitro di liquido. Più importante ancora, il test era altamente specifico. Quando i ricercatori hanno eseguito lo stesso test sul DNA di Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes — due batteri pericolosi che non fanno parte della famiglia delle Enterobacteriaceae — la macchina è rimasta silenziosa. Non è stato prodotto alcun segnale, confermando che i primer non si erano agganciati accidentalmente ai batteri sbagliati. Questa specificità è rimasta valida in tutti i diversi ceppi patogeni di Enterobacteriaceae testati, inclusi vari tipi di Salmonella e Shigella.

I ricercatori riconoscono che, sebbene il test funzioni perfettamente su colture pure di laboratorio, non è ancora stato validato su campioni complessi del mondo reale come campioni alimentari o clinici dei pazienti. Notano inoltre che lo studio ha utilizzato un numero limitato di ceppi batterici per la validazione. Tuttavia, i risultati dimostrano che la regione target universale cpn60 è un marcatore vitale e promettente per identificare questo pericoloso gruppo di batteri. Offrendo un metodo più veloce rispetto alla coltura tradizionale e più specifico rispetto ai vecchi test genetici, questo approccio potrebbe eventualmente aiutare i laboratori diagnostici a identificare le minacce alimentari e idriche molto più presto, limitando potenzialmente la diffusione delle infezioni e salvando vite umane.