Phylogenetic Analysis of cpn60 UT region reveal oligonucleotide regions for the detection of prominent Enterobacteriaceae pathogens

Bakterien sind überall, und während die meisten harmlos sind, umfasst eine spezifische Familie namens Enterobacteriaceae mehrere berüchtigte Unruhestifter. Diese Gruppe enthält Organismen wie E. coli, Salmonella und Shigella, die schwere Erkrankungen verursachen können, wenn Menschen kontaminierte Lebensmittel oder Wasser zu sich nehmen. Jahrzehntelang haben sich Wissenschaftler darauf verlassen, diese Bakterien im Labor zu züchten, um sie zu identifizieren – ein Prozess, der langsam ist und oft eine Woche oder mehr dauert, bis er eine definitive Antwort liefert. In der Zwischenzeit können sich Ausbrüche ausbreiten und Patienten warten auf eine Behandlung. Um dies zu beschleunigen, haben Forscher zu molekularen Werkzeugen gegriffen, die nach den einzigartigen genetischen Fingerabdrücken dieser Eindringlinge suchen. Es war jedoch eine beständige Herausforderung, einen genetischen Marker zu finden, der spezifisch genug ist, um alle gefährlichen Mitglieder dieser Familie zu erfassen, aber gleichzeitig unterschiedlich genug, um harmlose Bakterien zu ignorieren.

Ein Team von Forschern am Defence Institute of Biodefence Technologies in Indien hat dieses Problem angegangen, indem es sich auf einen spezifischen Teil des bakteriellen Genoms konzentrierte, das sogenannte cpn6ಲ್ಲ60-Gen. Dieses Gen ist in fast allen Bakterien vorhanden und fungiert als molekularer Helfer, der sicherstellt, dass Proteine die korrekten Formen annehmen, um funktionsfähig zu sein. Innerhalb dieses Gens liegt eine Region, die als „universelles Ziel“ bekannt ist – ein DNA-Abschnitt, der zwischen verschiedenen Bakterienarten stark genug variiert, um sie voneinander zu unterscheiden, aber innerhalb einer spezifischen Familie stabil genug bleibt, um als Gruppe erkannt zu werden. Die Forscher stellten die Hypothese auf, dass diese Region als zuverlässiges Ziel für einen Schnelltest dienen könnte, der gefährliche Enterobacteriaceae von anderen Bakterien unterscheidet.

Um diese Idee zu testen, sammelte das Team zunächst genetische Daten aus 236 verschiedenen Sequenzen dieser spezifischen Genregion, die in verschiedenen Enterobacteriaceae-Pathogenen gefunden wurden. Sie verwendeten Software, um diese Sequenzen nebeneinander aufzuordnen und nach Mustern zu suchen. Diese Analyse ergab, dass die Bakterien basierend auf ihrem genetischen Aufbau in 13 unterschiedliche Gruppen sortiert werden konnten. Während einige Gruppen einander sehr ähnlich waren, zeigten andere signifikante Unterschiede. Entscheidend war, dass die Forscher zwei kurze DNA-Abschnitte innerhalb dieser Sequenzen fanden, die über die gesamte Familie hinweg bemerkenswert konsistent blieben, selbst während sich der Rest des Gens veränderte. Diese stabilen Abschnitte fungierten wie eine gemeinsame Sprache, die von allen Zielbakterien geteilt wurde, was sie zu perfekten Stellen für die Entwicklung eines Detektionswerkzeugs machte.

Unter Verwendung dieser konservierten Regionen entwarfen die Wissenschaftler einen Satz molekularer Primer. Vereinfacht ausgedrückt sind Primer kurze Stücke genetischen Materials, die als Startpunkte für eine Maschine dienen, um ein bestimmtes DNA-Segment zu kopieren. Da die Bakterien in dieser Familie nicht alle identisch sind, mussten die Forscher „degenerate“ (degenere) Primer entwickeln. Das bedeutet, dass die Primer mit einem flexiblen Code entworfen wurden, der mehrere Variationen der DNA-Sequenz gleichzeitig erfassen konnte, um sicherzustellen, dass der Test für E. coli, Salmonella, Klebsiella und andere Mitglieder der Familie funktioniert, unabhängig von ihrem spezifischen Stamm. Sie entwickelten daraufhin ein Real-Time-PCR-Assay, eine Technik, die DNA vervielfältigt und mit einem fluoreszierenden Farbstoff aufleuchtet, falls das Ziel vorhanden ist, was eine sofortige visuelle Bestätigung ermöglicht.

Das Team testete dieses neue Assay im Labor unter Verwendung reiner Bakterienkulturen. Als sie DNA von E. coli einführten, funktionierte der Test schnell, detektierte die Bakterien nach nur 13 Zyklen der Amplifikation und erzeugte ein klares Signal. Der Test erwies sich als hochsensitiv und war in der Lage, so wenig wie 10 Bakterienzellen in einem Milliliter Flüssigkeit nachzuweisen. Viel wichtiger war, dass der Test hochspezifisch war. Als die Forscher denselben Test mit DNA von Staphylococcus aureus und Listeria monocytogenes durchführten – zwei gefährliche Bakterien, die nicht zur Familie der Enterobacteriaceae gehören – blieb die Maschine stumm. Es wurde kein Signal erzeugt, was bestätigte, dass die Primer nicht versehentlich an die falschen Bakterien andockten. Diese Spezifität blieb bei allen verschiedenen pathogenen Stämmen der Enterobacteriaceae bestehen, die die Forscher testeten, einschließlich verschiedener Arten von Salmonella und Shigella.

Die Forscher räumen ein, dass der Test an reinen Laborkulturen perfekt funktioniert, aber noch nicht an komplexen realen Proben wie Lebensmitteln oder klinischen Patientenproben validiert wurde. Sie merken auch an, dass die Studie eine begrenzte Anzahl von Bakterienstämmen für die Validierung verwendete. Dennoch zeigen die Ergebnisse, dass die cpn60-Universalzielregion ein lebensfähiger und vielversprechender Marker für die Identifizierung dieser gefährlichen Bakteriengruppe ist. Indem sie eine Methode anbieten, die schneller als die traditionelle Kultivierung und spezifischer als ältere genetische Tests ist, könnte dieser Ansatz Laboren letztlich helfen, lebensmittel- und wasserbedingte Bedrohungen viel früher zu identifizieren, was potenziell die Ausbreitung von Infektionen begrenzen und Leben retten kann.