Phylogenetic Analysis of cpn60 UT region reveal oligonucleotide regions for the detection of prominent Enterobacteriaceae pathogens

細菌はいたるところに存在しており、その多くは無害ですが、「腸内細菌科（Enterobacteriaceae）」として知られる特定のグループには、いくつかの悪名高い厄介者が含まれています。このグループには、大腸菌（E. coli）、サルモネラ菌（Salmonella）、赤痢菌（Shigella）などの微生物が含まれており、これらは汚染された食物や水を摂取した際に深刻な疾患を引き起こす可能性があります。数十年にわたり、科学者たちはこれらの細菌を特定するために、ラボでこれらを培養する方法に頼ってきましたが、このプロセスは時間がかかることが多く、確定的な答えを得るまでに1週間以上を要することもしばしばあります。その間にも、アウトブレイク（集団感染）は広がり続け、患者は治療を待たなければなりません。これを迅速化するために、研究者たちは、これら侵入者のユニークな遺伝的指紋を探し出す分子ツールへと目を向けました。しかし、この家族（科）の危険な全メンバーを捉えるのに十分なほど特異的でありながら、無害な細菌を無視できるほど十分に異なる遺伝的マーカーを見つけることは、長年の課題でした。

インドの国防バイオディフェンス技術研究所のチームは、cpn6个と呼ばれる細菌ゲノムの特定の領域に焦点を当てることで、この問題に取り組みました。この遺伝子は、ほぼすべての細菌に存在し、タンパク質が適切に機能するように正しい形に折り畳まれることを保証する「分子ヘルパー」として機能します。この遺伝子の中には「ユニバーサルターゲット」として知られる領域、つまり、異なる細菌種を区別できるほどには変化しつつも、特定の科（ファミリー）としては認識されるほどには安定しているDNAの領域が存在します。研究者たちは、この領域が、危険な腸内細菌科を他の細菌から区別するための信頼できる標的となり得ると仮説を立てました。

このアイデアを検証するため、チームはまず、さまざまな腸内細菌科の病原体から見つかった、この特定の遺伝子領域の236種類の異なる配列から遺伝データを収集しました。彼らはコンピュータソフトウェアを使用して、これらの配列を並べて比較し、パターンを探しました。この分析により、細菌は遺伝的構成に基づいて13の明確なグループに分類できることが明らかになりました。グループ同士が非常に似ているものもあれば、顕著な違いを示すものもありました。決定的なことに、研究者たちは、この家族（科）全体において、遺伝子が変化している最中であっても、驚くほど一貫して存在する、この配列内の2つの短いDNA領域を発見しました。これらの安定した領域は、標的となるすべての細菌によって共有される「共通言語」のように機能し、検出ツールを設計するための完璧な場所となりました。

これらの保存された領域を用いて、科学者たちは一連の分子プライマーを設計しました。簡単に言えば、プライマーとは、特定のDNAセグメントをコピーするための出発点として機能する短い遺伝物質のことです。この家族（科）の細菌はすべてが同一ではないため、研究者たちは「デジェネレート（縮重）プライマー」を作成する必要がありました。これは、プライマーが複数のDNA配列のバリエーションに同時に一致できる柔軟なコードを備えていることを意味し、これにより、特定の株に関係なく、大腸菌、サルモネラ菌、クレブシエラ菌、その他の家族（科）のメンバーに対してテストが機能することを保証しました。そして、彼らはリアルタイムPCRアッセイ、つまりDNAを増幅し、標的が存在する場合に蛍光色素で光る技術を構築し、即時の視覚的確認を可能にしました。

チームは、純粋培養された細菌を用いて、ラボ内でこの新しいアッセイをテストしました。大腸菌のDNAを導入すると、テストは迅速に機能し、わずか13サイクルの増幅で細菌を検出し、明確な信号を生み出しました。このテストは非常に高い感度を示し、1ミリリットルの液体中にわずか10個の細菌細胞がある状態でも検出することができました。さらに重要なことに、このテストは高い特異性を備えていました。研究者が、腸内細菌科には含まれない2つの危険な細菌である黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）とリステリア菌（Listeria monocytogenes）のDNAに対して同じテストを実行したところ、装置は沈黙を保ちました。信号は生成されず、プライマーが誤って他の細菌に付着しなかったことが確認されました。この特異性は、さまざまなタイプのサルモネラ菌や赤痢菌を含む、テストされたすべての異なる病原性の腸内細菌科の株に対して有効でした。

研究者たちは、このテストが純粋な実験室培養物には完璧に機能するものの、食品や臨床患者サンプルのような複雑な現実世界のサンプルについては、まだ検証されていないことを認めています。また、検証に使用された細菌株の数が限られていることも指摘しています。しかし、結果は、cpn60のユニバーサルターゲット領域が、この危険な細菌グループを特定するための実行可能で有望なマーカーであることを示しています。従来の培養法よりも速く、古い遺伝子テストよりも特異的な方法を提供することで、このアプローチは、最終的に診断ラボが食中毒や水系感染症の脅威をより早く特定するのを助け、感染の拡大を抑え、命を救うことに貢献する可能性があります。