Phylogenetic Analysis of cpn60 UT region reveal oligonucleotide regions for the detection of prominent Enterobacteriaceae pathogens

Bacteriën zijn overal, en hoewel de meeste onschadelijk zijn, omvat een specifieke familie bekend als Enterobacteriaceae verschillende beruchte boelmakers. Deze groep bevat organismen zoals E. coli, Salmonella en Shigella, die ernstige ziekte kunnen veroorzaken wanneer mensen besmet voedsel of water consumeren. Decennialang hebben wetenschappers vertrouwd op het kweken van deze bacteriën in een laboratorium om ze te identificeren, een proces dat traag is en vaak een week of langer duurt voordat er een definitief antwoord is. In de tussentijd kunnen uitbraken zich verspreiden en wachten patiënten op behandeling. Om dit te versnellen, hebben onderzoekers zich gericht op moleculaire instrumenten die zoeken naar de unieke genetische vingerafdrukken van deze indringers. Het is echter een hardnekkige uitdaging geweest om een genetische marker te vinden die specifiek genoeg is om alle gevaarlijke leden van deze familie te vangen, maar tegelijkertijd verschillend genoeg is om onschadelijke bacteriën te negeren.

Een team van onderzoekers aan het Defence Institute of Biodefence Technologies in India heeft dit probleem aangepakt door zich te concentreren op een specifiek deel van het bacteriële genoom genaamd het cpn60-gen. Dit gen is aanwezig in bijna alle bacteriën en fungeert als een moleculaire helper die ervoor zorgt dat eiwitten in de juiste vormen vouwen om te kunnen functioneren. Binnen dit gen ligt een regio die bekend staat als de "universele doelwit" (universal target), een stuk DNA dat voldoende varieert tussen verschillende bacteriesoorten om ze uit elkaar te houden, maar stabiel genoeg blijft binnen een specifieke familie om als groep te worden herkend. De onderzoekers hypotheten dat deze regio een betrouwbaar doelwit kon dienen voor een snelle test die gevaarlijke Enterobacteriaceae onderscheidt van andere bacteriën.

Om dit idee te testen, verzamelde het team eerst genetische gegevens van 236 verschillende sequenties van dit specifieke genregio gevonden in diverse Enterobacteriaceae-pathogenen. Ze gebruikten computersoftware om deze sequenties zij aan zij op te lijnen, zoekend naar patronen. Deze analyse onthulde dat de bacteriën op basis van hun genetische opbouw in 13 afzonderlijke groepen konden worden gesorteerd. Terwijl sommige groepen zeer vergelijkbaar waren met elkaar, vertoonden andere significante verschillen. Cruciaal was dat de onderzoekers twee korte stukken DNA binnen deze sequenties vonden die opmerkelijk consistent bleven over de gehele familie heen, zelfs terwijl de rest van het gen veranderde. Deze stabiele stukken fungeerden als een gemeenschappelijke taal die door alle doelbacteriën wordt gedeeld, waardoor ze perfecte locaties vormden voor het ontwerpen van een detectie-instrument.

Met behulp van deze geconserveerde regio's ontwierpen de wetenschappers een set moleculaire primers. In eenvoudige bewoordingen zijn primers korte stukjes genetisch materiaal die fungeren als startpunten voor een machine om een specifiek segment DNA te kopiëren. Omdat de bacteriën in deze familie niet allemaal identiek zijn, moesten de onderzoekers "degeneratieve" primers maken. Dit betekent dat de primers werden ontworpen met een flexibele code die meerdere variaties van de DNA-sequentie tegelijkertijd kon matchen, wat ervoor zorgt dat de test zou werken voor E. coli, Salmonella, Klebsiella en andere leden van de familie, ongeacht hun specifieke stam. Vervolgens bouwden ze een real-time PCR-assay, een techniek die DNA amplificeert en oplicht met een fluorescerende kleurstof als het doelwit aanwezig is, wat zorgt voor directe visuele bevestiging.

Het team testte hun nieuwe assay in het laboratorium met zuivere bacterieculturen. Wanneer ze DNA van E. coli introduceerden, werkte de test snel en detecteerde het de bacteriën na slechts 13 cycli van amplificatie, waarbij een duidelijk signaal werd geproduceerd. De test bleek zeer gevoelig; het was in staat om zelfs slechts 10 bacteriële cellen in een milliliter vloeistof te detecteren. Belangrijker nog, de test was zeer specifiek. Wanneer de onderzoekers dezelfde test uitvoerden op DNA van Staphylococcus aureus en Listeria monocytogenes — twee gevaarlijke bacteriën die geen deel uitmaken van de Enterobacteriaceae-familie — bleef de machine stil. Er werd geen signaal geproduceerd, wat bevestigde dat de primers niet per ongeluk aan de verkeerde bacteriën bleven haken. Deze specificiteit bleef standhouden bij alle verschillende pathogene stammen van de Enterobacteriaceae die zij testten, inclusief diverse typen Salmonella en Shigella.

De onderzoekers erkennen dat hoewel de test perfect werkt op zuivere laboratoriumculturen, deze nog niet is gevalideerd op complexe real-world monsters zoals voedsel of klinische patiëntenmonsters. Ze merken ook op dat de studie een beperkt aantal bacteriestammen gebruikte voor validatie. Desondanks tonen de resultaten aan dat de cpn60 universele doelwitregio een levensvatbare en veelbelovende marker is voor het identificeren van deze gevaarlijke groep bacteriën. Door een methode aan te bieden die sneller is dan traditionele kweekmethoden en specifieker dan oudere genetische tests, zou deze aanpak diagnostische laboratoria er uiteindelijk bij kunnen helpen om voedsel- en watergerelateerde dreigingen veel eerder te identificeren, wat potentieel de verspreiding van infecties kan beperken en levens kan redden.