Phylogenetic Analysis of cpn60 UT region reveal oligonucleotide regions for the detection of prominent Enterobacteriaceae pathogens

As bactérias estão em toda parte e, embora a maioria seja inofensiva, uma família específica conhecida como Enterobacteriaceae inclui vários problemas notórios. Este grupo contém organismos como E. coli, Salmonella e Shigella, que podem causar doenças graves quando as pessoas consomem alimentos ou água contaminados. Durante décadas, os cientistas confiaram no cultivo dessas bactérias em laboratório para identificá-las, um processo que é lento, levando frequentemente uma semana ou mais para fornecer uma resposta definitiva. Enquanto isso, surtos podem se espalhar e os pacientes esperam pelo tratamento. Para acelerar as coisas, pesquisadores recorreram a ferramentas moleculares que buscam as impressões digitéticas genéticas únicas desses invasores. No entanto, encontrar um marcador genético que seja específico o suficiente para capturar todos os membros perigosos desta família, mas diferente o suficiente para ignorar bactérias inofensivas, tem sido um desafio persistente.

Uma equipe de pesquisadores do Instituto de Defesa de Biodefesa da Índia abordou este problema concentrando-se em uma parte específica do genoma bacteriano chamada gene cpn60. Este gene está presente em quase todas as bactérias e atua como um auxiliar molecular, garantindo que as proteínas se dobrem nas formas corretas para funcionar adequadamente. Dentro deste gene reside uma região conhecida como o "alvo universal", um trecho de DNA que varia o suficiente entre diferentes espécies bacterianas para distingui-las, mas permanece estável o suficiente dentro de uma família específica para ser reconhecido como um grupo. Os pesquisadores hipotetizaram que esta região poderia servir como um alvo confiável para um teste rápido que distingue Enterobacteriaceae perigosas de outras bactérias.

Para testar essa ideia, a equipe primeiro reuniu dados genéticos de 236 sequências diferentes desta região específica do gene encontradas em várias Enterobacteriaceae patogênicas. Eles usaram um software de computador para alinhar essas sequências lado a lado, procurando por padrões. Esta análise revelou que as bactérias poderiam ser classificadas em 13 grupos distintos com base em sua composição genética. Embora alguns grupos fossem muito semelhantes entre si, outros mostravam diferenças significativas. Crucialmente, os pesquisadores descobriram dois curtos trechos de DNA dentro dessas sequências que permaneceram notavelmente consistentes em toda a família, mesmo enquanto o restante do gene mudava. Esses trechos estáveis atuaram como uma linguagem comum compartilhada por todas as bactérias alvo, tornando-os pontos perfeitos para projetar uma ferramenta de detecção.

Usando essas regiões conservadas, os cientistas projetaram um conjunto de iniciadores moleculares (primers). Em termos simples, os iniciadores são pequenos pedaços de material genético que atuam como pontos de partida para uma máquina copiar um segmento específico de DNA. Como as bactérias desta família não são todas idênticas, os pesquisadores tiveram que criar iniciadores "degenerados". Isso significa que os iniciadores foram projetados com um código flexível que poderia corresponder a múltiplas variações da sequência de DNA ao mesmo tempo, garantindo que o teste funcionasse para E. coli, Salmonella, Klebsiella e outros membros da família, independentemente de sua cepa específica. Eles então construíram um ensaio de PCR em tempo real, uma técnica que amplifica o DNA e brilha com um corante fluorescente se o alvo estiver presente, permitindo a confirmação visual imediata.

A equipe testou seu novo ensaio no laboratório usando culturas puras de bactérias. Quando introduziram o DNA de E. coli, o teste funcionou rapidamente, detectando as bactérias após apenas 13 ciclos de amplificação e produzindo um sinal claro. O teste provou ser altamente sensível, sendo capaz de detectar tão pouco quanto 10 células bacterianas em um mililitro de líquido. Mais importante ainda, o teste foi altamente específico. Quando os pesquisadores rodaram o mesmo teste no DNA de Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes — duas bactérias perigosas que não fazem parte da família Enterobacteriaceae — a máquina permaneceu silenciosa. Nenhum sinal foi produzido, confirmando que os iniciadores não se ligaram acidentalmente às bactérias erradas. Essa especificidade manteve-se verdadeira em todas as diferentes cepas patogênicas de Enterobacteriaceae que eles testaram, incluindo vários tipos de Salmonella e Shigella.

Os pesquisadores reconhecem que, embora o teste funcione perfeitamente em culturas laboratoriais puras, ele ainda não foi validado em amostras complexas do mundo real, como amostras de alimentos ou clínicas de pacientes. Eles também observam que o estudo utilizou um número limitado de cepas bacterianas para validação. No entanto, os resultados demonstram que a região alvo universal cpn60 é um marcador viável e promissor para identificar este grupo perigoso de bactérias. Ao oferecer um método que é mais rápido que o cultivo tradicional e mais específico do que testes genéticos antigos, esta abordagem pode eventualmente ajudar os laboratórios de diagnóstico a identificar ameaças transmitidas por alimentos e água muito mais cedo, potencialmente limitando a propagação de infecções e salvando vidas.