Phylogenetic Analysis of cpn60 UT region reveal oligonucleotide regions for the detection of prominent Enterobacteriaceae pathogens
यह अध्ययन फाइलोगैनेटिक विश्लेषण के माध्यम से cpn60 UT जीन के भीतर संरक्षित ओलिगोन्यूक्लियोटाइड क्षेत्रों की पहचान करता है और प्रमुख एंटरोबैक्टीरियासी (Enterobacteriaceae) रोगजनकों के तीव्र पता लगाने के लिए एक संवेदनशील और विशिष्ट SYBR ग्रीन रियल-टाइम PCR परख (assay) को डिजाइन करने के लिए उनका उपयोग करता है।
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बैक्टीरिया हर जगह मौजूद हैं, और हालांकि अधिकांश हानिरहित होते हैं, लेकिन 'एन्टेरोबैक्टीरियासी' (Enterobacteriaceae) नामक एक विशिष्ट परिवार में कई कुख्यात समस्या पैदा करने वाले जीव शामिल हैं। इस समूह में ई. कोलाई (E. coli), साल्मोनेला (Salmonella) और शिगेला (Shigella) जैसे जीव शामिल हैं, जो दूषित भोजन या पानी का सेवन करने पर गंभीर बीमारी का कारण बन सकते हैं। दशकों से, वैज्ञानिक इन बैक्टीरिया की पहचान करने के लिए उन्हें लैब में उगाने पर निर्भर रहे हैं, एक ऐसी प्रक्रिया जो एक निश्चित उत्तर देने में अक्सर एक सप्ताह या उससे अधिक समय लेती है। इस बीच, प्रकोप फैल सकते हैं और मरीज उपचार के लिए प्रतीक्षा करते हैं। इसे तेज करने के लिए, शोधकर्ताओं ने उन आणविक उपकरणों (molecular tools) की ओर रुख किया है जो इन हमलावरों के अद्वितीय आनुवंशिक फिंगरप्रिंट्स की तलाश करते हैं। हालांकि, एक ऐसा आनुवंशिक मार्कर खोजना जो इस पूरे परिवार के सभी खतरनाक सदस्यों को पकड़ने के लिए पर्याप्त विशिष्ट हो, फिर भी हानिरहित बैक्टीरिया को अनदेखा करने के लिए पर्याप्त भिन्न हो, एक निरंतर चुनौती रही है।
भारत में 'डिफेंस इंस्टीट्यूट ऑफ बायोडिफेंस टेक्नोलॉजीज' के शोधकर्ताओं की एक टीम ने 'सीपीएन60' (cpn60) जीन नामक बैक्टीरिया के जीनोम के एक विशिष्ट भाग पर ध्यान केंद्रित करके इस समस्या को हल किया है। यह जीन लगभग सभी बैक्टीरिया में मौजूद होता है और एक आणविक सहायक के रूप में कार्य करता है, जो यह सुनिश्चित करता है कि प्रोटीन सही आकार में मुड़ें ताकि वे ठीक से कार्य कर सकें। इस जीन के भीतर एक क्षेत्र है जिसे "यूनिवर्सल टारगेट" (universal target) कहा जाता है, जो डीएनए का एक ऐसा हिस्सा है जो विभिन्न बैक्टीरिया प्रजातियों के बीच इतना भिन्न होता है कि वे एक-दूसरे से अलग पहचाने जा सकें, लेकिन एक विशिष्ट परिवार के भीतर इतना स्थिर रहता है कि उसे एक समूह के रूप में पहचाना जा सके। शोधकर्ताओं ने परिकल्पना की कि यह क्षेत्र खतरनाक एन्टेरोबैक्टीरियासी को अन्य बैक्टीरिया से अलग करने वाले एक तीव्र परीक्षण के लिए एक विश्वसनीय लक्ष्य के रूप में कार्य कर सकता है।
इस विचार का परीक्षण करने के लिए, टीम ने पहले विभिन्न एन्टेरोबैक्टीरियासी रोगजनकों में पाए जाने वाले इस विशिष्ट जीन क्षेत्र के 236 अलग-अलग अनुक्रमों (sequences) से डेटा एकत्र किया। उन्होंने इन अनुक्रमों को एक साथ व्यवस्थित करने और पैटर्न खोजने के लिए कंप्यूटर सॉफ्टवेयर का उपयोग किया। इस विश्लेषण से पता चला कि बैक्टीरिया को उनके आनुवंशिक मेकअप के आधार पर 13 विशिष्ट समूहों में बांटा जा सकता है। जबकि कुछ समूह आपस में बहुत समान थे, अन्य महत्वपूर्ण अंतर दिखाते थे। महत्वपूर्ण रूप से, शोधकर्ताओं ने पाया कि इन अनुक्रमों के भीतर डीएनए के दो छोटे हिस्से पूरे परिवार में उल्लेखनीय रूप से सुसंगत बने रहे, भले ही बाकी जीन बदल गया हो। ये स्थिर हिस्से एक सामान्य भाषा की तरह काम करते थे जिसे सभी लक्षित बैक्टीरिया साझा करते थे, जिससे वे एक पहचान उपकरण डिजाइन करने के लिए आदर्श स्थान बन गए।
इन संरक्षित क्षेत्रों का उपयोग करते हुए, वैज्ञानिकों ने आणविक प्राइमर्स (primers) का एक सेट डिजाइन किया। सरल शब्दों में, प्राइमर्स आनुवंशिक सामग्री के छोटे टुकड़े होते हैं जो मशीन के लिए डीएनए के एक विशिष्ट खंड की प्रतिलिपि बनाने के लिए शुरुआती बिंदु के रूप में कार्य करते हैं। चूंकि इस परिवार के सभी बैक्टीरिया एक जैसे नहीं होते हैं, इसलिए शोधकर्ताओं को "डिजेनरेट" (degenerate) प्राइमर्स बनाने पड़े। इसका अर्थ यह है कि प्राइमर्स को एक लचीले कोड के साथ डिजाइन किया गया था जो डीएनए अनुक्रम के कई विविधताओं से एक साथ मेल खा सके, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि परीक्षण ई. कोलाई, साल्मोनेला, क्लेबसिएला और परिवार के अन्य सदस्यों के लिए काम करेगा, चाहे उनका विशिष्ट स्ट्रेन कुछ भी हो। इसके बाद उन्होंने एक रियल-टाइम पीसीआर (real-time PCR) परख बनाई, जो एक ऐसी तकनीक है जो डीएनए को प्रवर्धित करती है और यदि लक्ष्य मौजूद है तो फ्लोरोसेंट डाई के साथ चमकती है, जिससे तत्काल दृश्य पुष्टि संभव होती है।
टीम ने प्रयोगशाला में बैक्टीरिया के शुद्ध कल्चर का उपयोग करके अपने नए परख का परीक्षण किया। जब उन्होंने ई. कोलाई का डीएनए पेश किया, तो परीक्षण तेजी से काम कर गया, जिसने केवल 13 प्रवर्धन चक्रों (amplification cycles) के बाद बैक्टीरिया का पता लगाया और एक स्पष्ट संकेत दिया। परीक्षण अत्यधिक संवेदनशील साबित हुआ, जो एक मिलीलीटर तरल में केवल 10 बैक्टीरिया कोशिकाओं का पता लगाने में सक्षम था। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि परीक्षण अत्यधिक विशिष्ट था। जब शोधकर्ताओं ने उसी परीक्षण को स्टैफिलोकोकस ऑरियस (Staphylococcus aureus) और लिस्टेरिया मोनोसाइटोजेन्स (Listeria monocytogenes) के डीएनए पर चलाया—जो एन्टेरोबैक्टीरियासी परिवार के नहीं बल्कि दो खतरनाक बैक्टीरिया हैं—तो मशीन शांत रही। कोई संकेत उत्पन्न नहीं हुआ, जिससे पुष्टि हुई कि प्राइमर्स ने गलती से गलत बैक्टीरिया को नहीं पकड़ा। यह विशिष्टता एन्टेरोबैक्टीरियासी के विभिन्न रोगजनक उपभेदों (strains) सहित, सभी परीक्षण किए गए उपभेदों पर सटीक रही, जिसमें साल्मोनेला और शिगेला के विभिन्न प्रकार शामिल थे।
शोधकर्ता स्वीकार करते हैं कि हालांकि यह परीक्षण प्रयोगशाला के शुद्ध कल्चर पर पूरी तरह से काम करता है, लेकिन अभी तक इसे भोजन या नैदानिक रोगी नमूनों जैसे जटिल वास्तविक दुनिया के नमूनों पर मान्य (validate) नहीं किया गया है। वे यह भी नोट करते हैं कि अध्ययन ने सत्यापन के लिए बैक्टीरिया के सीमित संख्या में उपभेदों का उपयोग किया। हालांकि, परिणाम दर्शाते हैं कि cpn60 यूनिवर्सल टारगेट क्षेत्र इस खतरनाक बैक्टीरिया समूह की पहचान करने के लिए एक व्यवहार्य और आशाजनक मार्कर है। पारंपरिक कल्चरिंग की तुलना में अधिक तेज़ और पुराने आनुवंशिक परीक्षणों की तुलना में अधिक विशिष्ट विधि प्रदान करके, यह दृष्टिकोण अंततः नैदानिक प्रयोगशालाओं को खाद्य जनित और जल जनित खतरों की पहचान बहुत पहले करने में मदद कर सकता है, जिससे संक्रमण के प्रसार को सीमित करने और जीवन बचाने की संभावना बढ़ सकती है।
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