Engineering Yarrowia lipolytica for efficient geraniol production via hp4d promoter-driven geraniol synthase expression

في عالم التصنيع الصناعي، تُعد بعض المكونات الأكثر قيمة للعطور والأغذية والأدوية جزيئات صغيرة تسمى "التربينات". ومن أكثرها طلباً هو "الجيرانيول"، وهو مركب عطري يمنح الورود والليمون العشبي رائحتهما المميزة. لقرون مضت، قام البشر بحصاد الجيرانيول عن طريق سحق حقول شاسعة من النباتات، وهي عملية بطيئة ومكلفة وتعتمد على تقلبات الطقس. ولحل هذه المشكلة، توجه العلماء إلى العالم المجهري، حيث قاموا بتدريب كائنات وحيدة الخلية لتعمل كمصانع صغيرة تنتج هذه المواد الكيميائية في المختبر. والهدف هو إيجاد مضيف بيولوجي يكون قويًا، وفعالًا، وقادرًا على إنتاج هذه الجزيئات دون أن يتسمم بها.

يتمثل التحدي الرئيسي في هذا المجال في السمية. فالعديد من هذه المواد الكيميائية القيمة، بما في ذلك الجيرانيول، ضارة بالخلايا التي تصنعها نفسها. فإذا أنتج الميكروب كمية كبيرة جدًا من المادة الكيميائية بسرعة كبيرة، يمكن لهذه المادة أن تسبب ضررًا للغشاء الخارجي للخلية، مما يؤدي إلى توقف المصنع عن العمل قبل أن تتاح له الفرصة للنمو بما يكفي ليكون مفيدًا. وللتغلب على ذلك، يحاول الباحثون غالبًا فصل مرحلة النمو عن مرحلة الإنتاج، مما يسمح للخلايا ببناء أعدادها أولاً ثم تبدأ في تصنيع المنتج بمجرد استقرارها تمامًا. ويتطلب هذا تحكمًا دقيقًا في المفاتيح الجينية التي تشغل جينات الإنتاج وتوقفها.

في دراسة حديثة، عالج باحثون في جامعة ساو باولو هذا التحدي باستخدام نوع من الخميرة يسمى "ياروسيا ليبوليتيكا" (Yarrowia lipolytica). وتُعد هذه الخميرة تحديدًا مفضلة لدى المهندسين لأنها تتعامل طبيعيًا مع مستويات عالية من الجزيئات الغنية بالطاقة وهي قوية جدًا، وقادرة على البقاء في الظروف القاسية التي قد تفشل فيها ميكروبات أخرى. أراد الفريق معرفة ما إذا كان بإمكانهم برمجة هذه الخميرة لإنتاج الجيرانيول بكفاءة باستخدام مفتاح جيني محدد يؤخر الإنتاج حتى تنتهي الخميرة من النمو. وقد ركزوا على محفز جيني قوي، وهو تسلسل من الحمض النووي يعمل مثل مفتاح خافت للجينات، يُعرف باسم محفز "hp4d". وبخلاف المفاتيح القياسية التي تشغل الجينات فورًا، يظل هذا المحفز هادئًا نسبيًا خلال مرحلة النمو السريع، ويبدأ في رفع نشاطه فقط عندما تتباطأ الخلايا وتدخل في حالة الراحة.

بدأ الباحثون بأخذ جين من نبات "ونكا مدغشقر"، الذي يحتوي طبيعيًا على التعليمات اللازمة لصنع إنزيم "جيرانيول سينثيز"، وهو الإنزيم المسؤول عن إنشاء الجزيء. وقاموا بتقليم هذا الجين ليعمل بشكل أفضل داخل الخميرة ثم ربطوه بمحفز "hp4d". وباستخدام أداة تعديل جيني حديثة تُعرف باسم "CRISPR-Cas9"، والتي تعمل مثل مقصات جزيئية لإدخال حمض نووي جديد في مواقع محددة، قاموا بدمج هذه الحزمة الجينية الجديدة في جينوم الخميرة. وقد اختاروا سلالة معينة من الخميرة تم هندستها مسبقًا لتكون ذات مسار داخلي فائق القدرة لبناء المواد الخام اللازمة للجيرانيول. وكانت النتيجة سلالة جديدة أطلقوا عليها اسم "BYa3105".

عندما قام الفريق بتنمية خلايا الخميرة الجديدة هذه في المختبر، لاحظوا فرقًا واضحًا في السلوك مقارنة بالخميرة الأصلية غير المعدلة. نجحت السلالة الجديدة في إنتاج الجيرانيول، حيث وصلت تركيزاته إلى ما يقرب من 295 ملليجرام لكل لتر بعد يومين من النمو. أما سلالات الخميرة الأصلية، التي تفتقر إلى الحزمة الجينية الجديدة، فلم تنتج أي جيرانيول على الإطلاق. وقد أكد ذلك أن الإنتاج مرتبط مباشرة بالجين الجديد الذي أدخلوه. ومع ذلك، لاحظ الباحثون أيضًا وجود مقايضة؛ فقد انتهت السلالة الجديدة بكتلة إجمالية أقل بنسبة 22 في المائة عن الخميرة الأصلية. ورغم هذا الانخفاض في الحجم النهائي، ظلت الخلايا سليمة وحية، ولم تضطرب قدرتها على تخزين الدهون، وهي سمة طبيعية لهذه الخميرة. كما نمت الخلايا بنفس سرعة الخلايا الأصلية خلال المراحل المبكرة، مما يشير إلى أن التغييرات الجينية لم تعطلها أثناء انشغالها بالتكاثر.

تطابق توقيت الإنتاج فرضية الباحثين تمامًا. فلم يظهر الجيرانيول بكميات كبيرة أثناء نمو الخميرة السريع، بل بدأ في التراكم بشكل ملحوظ فقط بعد أن بدأ معدل النمو في التباطؤ، ووصل إلى ذروته حوالي الساعة 48. أكد هذا النمط أن محفز "hp4d" كان يقوم بالضبط بما صُمم لأجله: لقد سمح للخميرة ببناء تعداد كبير أولاً، ثم قام بتشغيل آلات صنع الجيرانيول بعد ذلك. وهذا التأخير هو استراتيجية حاسمة لأنه يمنع تراكم المادة الكيميائية السامة أثناء كون الخلايا في أكثر حالات ضعفها، مما يفصل فعليًا بين نمو المصنع وتصنيع المنتج.

ومع استمرار التجربة لما بعد 48 ساعة، بدأت كمية الجيرانيول في الوعاء في الانخفاض. حقق الباحثون في مسألة ما إذا كان ذلك بسبب تبخر المادة أو تحللها من تلقاء نفسها، فأجروا اختبار ضبط باستخدام المادة الكيميائية وحدها في السائل، دون وجود خميرة، ووجدوا أن المادة ظلت مستقرة. أدى ذلك إلى استبعاد التبخر البسيط أو عدم الاستقرار الكيميائي كسبب. وبدلاً من ذلك، أشارت البيانات إلى أن خلايا الخميرة نفسها كانت تحول الجيرانيول إلى مواد أخرى مع مرور الوقت. كما وجد الفريق أن كمية السكر المتوفرة في السائل لعبت دورًا رئيسيًا؛ فعندما زادوا تركيز السكر، أنتجت الخميرة المزيد من الجيرانيول، ولكن حتى حد معين فقط. فإضافة الكثير من السكر لم تؤدِ إلى زيادة متناسبة في المنتج النهائي، ويرجع ذلك على الأرجح إلى تحول الخلايا نحو تخزين الدهون أو تشبع المسارات الأيضية.

تخلص الدراسة إلى أن هذا النهج يعد طريقة واعدة لإنتاج الجيرانيول في المختبر. فمن خلال استخدام مفتاح جيني محدد لتأخير الإنتاج حتى تنتهي الخميرة من النمو، تمكن الفريق من إنشاء سلالة تنتج مادة كيميائية قيمة دون أن تقتل نفسها في العملية. وبينما كان الحجم النهائي للخميرة أقل قليلاً، ظلت الخلايا حيوية وسليمة، ونجحت استراتيجية الإنتاج في تقليل الإجهاد الناتج عن المادة الكيميائية السامة. وتسلط النتائج الضوء على أن إدارة توقيت الإنتاج لا تقل أهمية عن الهندسة الجينية نفسها، مما يقدم مخططًا لبناء مصانع بيولوجية أكثر قوة وكفاءة في المستقبل.