Engineering Yarrowia lipolytica for efficient geraniol production via hp4d promoter-driven geraniol synthase expression

산업 제조 분야에서 향수, 식품, 의약품의 가장 가치 있는 성분 중 일부는 테르펜(terpenes)이라고 불리는 아주 작은 분자들입니다. 그중에서도 가장 수요가 높은 것 중 하나는 장미와 레몬그라스 특유의 향기를 선사하는 향기로운 화합물인 게라니올(geraniol)입니다. 수 세기 동안 인류는 광활한 식물 벌판을 으깨어 게라니올을 채취해 왔으나, 이 과정은 느리고 비용이 많이 들며 날씨의 변덕에 좌우된다는 단점이 있습니다. 이를 해결하기 위해 과학자들은 미생물의 세계로 눈을 돌려, 단세포 생물이 실험실에서 이러한 화학 물질을 생산하는 작은 공장 역할을 하도록 훈련시켰습니다. 목표는 견고하고 효율적이며, 스스로 만든 분자에 의해 독성을 입지 않고도 이를 생산할 수 있는 생물학적 숙주를 찾는 것입니다.

이 분야의 주요 과제는 독성입니다. 게라니올을 포함한 많은 가치 있는 화학 물질들은 그것을 만들어내는 바로 그 세포에 해롭습니다. 만약 미생물이 화학 물질을 너무 많이, 너무 빠르게 생산하면, 그 화학 물질이 세포의 외막을 손상시켜 공장이 유용할 만큼 충분히 성장하기도 전에 가동을 중단하게 만들 수 있습니다. 이를 극복하기 위해 연구자들은 종종 성장 단계와 생산 단계를 분리하여, 세포가 먼저 숫자를 늘린 후 충분히 자리를 잡았을 때만 제품 제조를 시작하도록 합니다. 이를 위해서는 생산 유전자를 켜고 끄는 유전적 스위치를 정밀하게 제어하는 것이 필요합니다.

최근 연구에서 상파울루 대학교의 연구진은 Yarrowia lipolytica라는 효모를 사용하여 이 과제에 도전했습니다. 이 특정 효모는 에너지 함량이 높은 분자들을 자연적으로 잘 다루고, 다른 미생물들이 실패할 법한 가혹한 환경에서도 살아남을 수 있을 만큼 매우 강인하여 엔지니어들에게 사랑받는 종입니다. 연구팀은 특정 유전적 스위치를 사용하여 성장이 끝난 후에 생산을 지연시킴으로써, 이 효모가 게라니올을 효율적으로 생산할 수 있는지 확인하고자 했습니다. 그들은 유전자의 활동을 조절하는 '디머 스위치(dimmer switch)' 역할을 하는 강력한 유전자 프로모터인 hp4d 프로모터에 주목했습니다. 즉각적으로 유전자를 켜는 표준 스위치와 달리, 이 프로모터는 세포가 빠르게 성장하는 단계에서는 비교적 조용하게 유지되다가, 세포의 성장이 느려지고 휴면 상태에 진입할 때 활동을 본격적으로 높입니다.

연구진은 먼저 마다가스카르 일일초(Madagascar periwinkle) 식물에서 유래한 유전자를 가져왔는데, 이 식물은 게라니올을 만드는 효소인 게라니올 합성 효소를 만드는 지침을 자연적으로 포함하고 있습니다. 연구진은 이 유전자가 효모 내에서 더 잘 작동하도록 다듬은 뒤, 이를 hp4d 프로서와 결합했습니다. 또한, 분자 가위 역할을 하는 현대적인 유전자 편집 도구인 CRISPR-Cas9을 사용하여 이 새로운 유전적 패키지를 효모의 게놈에 삽입했습니다. 연구진은 게라니올의 원료를 구축하는 데 필요한 내부 경로가 이미 초강력하게 강화된 특정 효모 균주를 선택했습니다. 그 결과, 그들은 이 새로운 균주에 BYa3105라는 이름을 붙였습니다.

연구팀이 실험실에서 이 새로운 효모 세포를 배양했을 때, 수정되지 않은 원래의 효쏘와 비교하여 명확한 행동 차이를 관찰했습니다. 새로운 균주는 게라니올을 성공적으로 생산하여, 2일간의 성장 후 거의 리터당 295밀리그램의 농도에 도달했습니다. 새로운 유전적 패키지가 없는 원래의 효모 균주들은 게라니올을 전혀 생산하지 못했습니다. 이는 생산이 삽입된 새로운 유전자와 직접적으로 연결되어 있음을 확인시켜 주었습니다. 그러나 연구진은 한 가지 절충점(trade-off)을 발견했습니다. 새로운 균주는 원래의 효모보다 전체 질량이 약 22% 적게 나타났습니다. 이러한 최종 크기의 감소에도 불구하고, 세포들은 건강하고 살아있는 상태를 유지했으며, 이 효모의 자연스러운 특성인 지방 저장 능력도 방해받지 않았습니다. 세포들은 초기 성장 단계에서 원래의 효모와 동일한 속도로 성장했는데, 이는 유전적 변화가 세포가 증식하는 동안 속도를 늦추지 않았음을 시사합니다.

생산 타이밍은 연구진의 가설과 완벽하게 일치했습니다. 효모가 빠르게 성장하는 동안에는 게라니올이 대량으로 나타나지 않았습니다. 대신, 성장률이 둔화되기 시작한 후에야 화학 물질이 눈에 띄게 축적되었으며, 48시간 지점에서 정점에 도달했습니다. 이 패턴은 hp4d 프로모터가 설계된 대로 정확히 작동했음을 확인해 주었습니다. 즉, 세포가 먼저 대규모 개체군을 형성하게 한 뒤, 그 후에야 게라니올 제조 기계를 가동한 것입니다. 이러한 지연 전략은 세포가 가장 취약한 시기에 독성 화학 물질이 축적되는 것을 방지함으로써, 공장의 성장과 제품의 제조를 효과적으로 분리하는 데 결정적인 역할을 합니다.

실험이 48시간을 지나 계속됨에 따라 플라스크 안의 게라니올 양이 줄어들기 시작했습니다. 연구진은 이것이 화학 물질이 증발하거나 스스로 분해되었기 때문인지 조사했습니다. 그들은 효모 없이 화학 물질만 들어 있는 액체로 대조 실험을 실시했고, 화학 물질이 안정적으로 유지된다는 것을 발견했습니다. 이를 통해 단순한 증발이나 화학적 불안정성을 원인에서 제외했습니다. 대신, 데이터는 시간이 지남에 따라 효모 세포 자체가 게라니올을 다른 물질로 변형시키고 있음을 시사했습니다. 또한 연구팀은 액체 내의 당 농도가 중요한 역할을 한다는 것도 발견했습니다. 당 농도를 높였을 때 게라니올 생산량도 증가했지만, 특정 지점까지만 그러했습니다. 당을 너무 많이 추가해도 최종 생성물이 비례해서 늘어나지는 않았는데, 이는 세포가 에너지를 지방 저장으로 돌렸거나 대사 경로가 포화 상태가 되었기 때문인 것으로 보입니다.

이 연구는 이 방식이 실험실 환경에서 게라니올을 제조하는 유망한 방법임을 결론짓습니다. 특정 유전적 스위치를 사용하여 성장이 끝날 때까지 생산을 지연시킴으로써, 연구팀은 독성 화학 물질에 의해 스스로 죽지 않으면서도 귀중한 화학 물질을 생산하는 균주를 만들어냈습니다. 최종 효모의 양은 약간 적어졌지만, 세포들은 생존력이 높고 건강한 상태를 유지했으며, 생산 전략은 독성 화학 물질에 의한 스트레스를 효과적으로 최소화했습니다. 이 연구 결과는 생산의 타이밍을 관리하는 것이 유전자 편집 자체만큼 중요하다는 점을 강조하며, 미래를 위한 더 견고하고 효율적인 생물학적 공장을 구축하기 위한 청사진을 제시합니다.