Engineering Yarrowia lipolytica for efficient geraniol production via hp4d promoter-driven geraniol synthase expression

In de wereld van de industriële productie zijn sommige van de meest waardevolle ingrediënten voor parfums, voedingsmiddelen en medicijnen kleine moleculen die terpen worden genoemd. Een van de meest gezochte is geraniol, een geurige verbinding die rozen en citroengras hun kenmerkende geur geeft. Eeuwenlang hebben mensen geraniol geoogst door enorme velden planten te pletten, een proces dat traag, duur en afhankelijk is van de grillen van het weer. Om dit op te lossen, hebben wetenschappers zich tot de microscopische wereld gewend, waarbij ze eencellige organismen hebben getraind om te fungeren als kleine fabrieken die deze chemicaliën in een laboratorium produceren. Het doel is om een biologische gastheer te vinden die robuust, efficiënt en in staat is om deze moleculen te produceren zonder erdoor vergiftigd te worden.

Een grote uitdaging in dit veld is toxiciteit. Veel van deze waardevolle chemicaliën, waaronder geraniol, zijn schadelijk voor de cellen die ze zelf maken. Als een microbe te veel van de chemische stof te snel produceert, kan de stof het celmembraan beschadigen, waardoor de fabriek sluit voordat deze groot genoeg is om nuttig te zijn. Om dit te overwinnen, proberen onderzoekers vaak de groeifase te scheiden van de productiefase, waardoor de cellen eerst hun aantallen kunnen opbouwen en pas beginnen met de productie van het product zodra ze volledig gevestigd zijn. Dit vereist nauwkeurige controle over de genetische schakelaars die de productie-genen aan- en uitzetten.

In een recente studie pakten onderzoekers van de Universiteit van São Paulo deze uitdaging aan met behulp van een gist genaamd Yarrowia lipolytica. Deze specifieke gist is een favoriet onder ingenieurs omdat hij van nature hoge concentraties energierijke moleculen verwerkt en zeer taai is, in staat om te overleven in barre omstandigheden waar andere microben zouden falen. Het team wilde zien of ze deze gist konden programmeren om geraniol efficiënt te produceren door een specifieke genetische schakelaar te gebruiken die de productie uitstelt totdat de gist klaar is met groeien. Ze richtten zich op een krachtige genetische promotor, een sequentie van DNA die fungeert als een dimschakelaar voor genen, bekend als de hp4d-promotor. In tegen tegenstelling tot standaard schakelaars die genen onmiddellijk inschakelen, blijft deze relatief stil tijdens de snelle groeifase en neemt de activiteit pas toe wanneer de cellen vertragen en in een rusttoestand terechtkomen.

De onderzoekers begonnen door een gen uit een Madagascar periwinkle-plant te nemen, die van nature de instructies bevat voor het maken van geraniolsynthase, het enzym dat verantwoordelijk is voor het creëren van het molecuul. Ze knipten dit gen bij om het beter te laten werken in de gist en verbonden het vervolgens met de hp4d-promotor. Met behulp van een moderne genbewerkingstool genaamd CRISPR-Cas9, die werkt als een moleculaire schaar om nieuw DNA op specifieke locaties in te voegen, integreerden ze dit nieuwe genetische pakket in het genoom van de gist. Ze kozen een specifieke stam van de gist die al vooraf is bewerkt om een supergeladen intern pad te hebben voor het bouwen van de grondstoffen die nodig zijn voor geraniol. Het resultaat was een nieuwe stam die ze BYa3105 noemden.

Toen het team deze nieuwe gistcellen in het laboratorium kweekte, observeerden ze een duidelijk verschil in gedrag vergeleken met de oorspronkelijke, ongewijzigde gist. De nieuwe stam produceerde succesvol geraniol, waarbij een concentratie van bijna 295 milligram per liter werd bereikt na twee dagen groei. De oorspronkelijke giststammen, die het nieuwe genetische pakket misten, produceerden helemaal geen geraniol. Dit bevestigde dat de productie direct gekoppeld was aan het nieuwe gen dat ze hadden ingevoegd. De onderzoekers merkten echter ook een compromis op. De nieuwe stam eindigde met ongeveer 22 procent minder totale massa dan de oorspronkelijke gist. Ondanks deze vermindering in uiteindelijke omvang bleven de cellen gezond en levend, en werd hun vermogen om vetten op te slaan, een natuurlijke eigenschap van deze gist, niet verstoord. De cellen groeiden met dezelfde snelheid als de oorspronkelijke tijdens de vroege stadia, wat suggereert dat de genetische veranderingen hen niet vertraagden terwijl ze bezig waren met vermenigvuldigen.

De timing van de productie kwam precies overeen met de hypothese van de onderzoekers. Het geraniol verscheen niet in grote hoeveelheden terwijl de gist snel groeide. In plaats daarvan begon de chemische stof pas significant te accumuleren nadat de groeisnelheid begon te vertragen, met een piek rond het 48-uurs punt. Dit patroon bevestigde dat de hp4d-promotor precies deed waarvoor hij was ontworpen: het liet de gist eerst een grote populatie opbouwen, en schakelde pas daarna de machines in om de geraniol te maken. Deze vertraging is een cruciale strategie omdat het voorkomt dat de toxische stof zich opbouwt terwijl de cellen het meest kwetsbaar zijn, waardoor de groei van de fabriek effectief wordt ontkoppeld van de productie van het product.

Terwijl het experiment voorbij de 48 uur voortduurde, begon de hoeveelheid geraniol in de kolf te dalen. De onderzoekers onderzochten of dit kwam door verdamping of doordat de stof uit zichzelf afbrak. Ze voerden een controletest uit met alleen de chemische stof in de vloeistof, zonder enige gist, en stelden vast dat de stof stabiel bleef. Dit sloot eenvoudige verdamping of chemische instabiliteit als oorzaak uit. In plaats daarvan suggereerden de gegevens dat de gistcellen zelf de geraniol in de loop van de tijd in andere stoffen transformeerden. Het team ontdekte ook dat de hoeveelheid suiker die beschikbaar was in de vloeistof een belangrijke rol speelde. Wanneer ze de suikerconcentratie verhoogden, produceerde de gist meer geraniol, maar slechts tot op zekere hoogte. Te veel suiker toevoegen leidde niet tot een evenredige toename van het eindproduct, waarschijnlijk omdat de cellen hun energie verschoven naar de opslag van vet of omdat de metabole paden verzadigd raakten.

De studie concludeert dat deze aanpak een veelbelovende manier is om geraniol in een laboratoriumsetting te maken. Door een specifieke genetische schakelaar te gebruiken om de productie uit te stellen tot de gist klaar is met groeien, slaagde het team erin een stam te creëren die een waardevolle chemische stof produceert zonder zichzelf in het proces te doden. Hoewel de uiteindelijke hoeveelheid gist iets lager was, bleven de cellen levensvatbaar en gezond, en de productiestrategie slaagde erin de stress veroorzaakt door de toxische stof te minimaliseren. De bevindingen benadrukken dat het beheren van de timing van de productie net zo belangrijk is als de genetische manipulatie zelf, wat een blauwdruk biedt voor het bouwen van robuustere en efficiëntere biologische fabrieken voor de toekomst.