Engineering Yarrowia lipolytica for efficient geraniol production via hp4d promoter-driven geraniol synthase expression

En el mundo de la fabricación industrial, algunos de los ingredientes más valiosos para perfumes, alimentos y medicinas son unas diminutas moléculas llamadas terpenos. Uno de los más codiciados es el geraniol, un compuesto fragante que otorga a las rosas y al limoncillo su aroma distintivo. Durante siglos, los seres humanos han cosechado geraniol triturando vastos campos de plantas, un proceso que es lento, costoso y dependiente de los caprichos del clima. Para resolver esto, los científicos se han vuelto hacia el mundo microscópico, entrenando a organismos unicelulares para que actúen como diminutas fábricas que producen estos productos químicos en un laboratorio. El objetivo es encontrar un huésped biológico que sea robusto, eficiente y capaz de producir estas moléculas sin ser envenenado por ellas.

Un desafío importante en este campo es la toxicidad. Muchos de estos productos químicos valiosos, incluyendo el geraniol, son dañinos para las mismas células que los producen. Si un microbio produce demasiado producto químico con demasiada rapidez, la sustancia puede dañar la membrana externa de la célula, provocando que la fábrica se detenga antes de que tenga la oportunidad de crecer lo suficiente para ser útil. Para superar esto, los investigadores suelen intentar separar la fase de crecimiento de la fase de producción, permitiendo que las células aumenten su número primero y solo comiencen a fabricar el producto una vez que estén plenamente establecidas. Esto requiere un control preciso sobre los interruptores genéticos que encienden y apagan los genes de producción.

En un estudio reciente, investigadores de la Universidad de São Paulo abordaron este desafío utilizando una levadura llamada Yarrowia lipolytica. Esta levadura en particular es una favorita entre los ingenieros porque maneja naturalmente niveles altos de moléculas ricas en energía y es muy resistente, capaz de sobrevivir en condiciones duras donde otros microbios fallarían. El equipo quería ver si podían programar esta levadura para producir geraniol de manera eficiente mediante el uso de un interruptor genético específico que retrase la producción hasta que la levadura haya terminado de crecer. Se centraron en un promotor genético potente, una secuencia de ADN que actúa como un regulador de intensidad para los genes, conocido como el promotor hp4d. A diferencia de los interruptores estándar que encienden los genes de inmediato, este permanece relativamente silencioso durante la fase de crecimiento rápido y solo aumenta su actividad a medida que las células se ralentizan y entran en un estado de reposo.

Los investigadores comenzaron tomando un gen de una planta de vinca de Madagascar, que contiene naturalmente las instrucciones para fabricar la geraniol sintasa, la enzima responsable de crear la molécula. Recortaron este gen para que funcionara mejor dentro de la levadura y luego lo unieron al promotor hp4d. Utilizando una herramienta de edición genética moderna conocida como CRISPR-Cas9, que actúa como tijeras moleculares para insertar nuevo ADN en ubicaciones específicas, integraron este nuevo paquete genético en el genoma de la levadura. Eligieron una cepa específica de levadura que ya había sido pre-diseñada mediante ingeniería para tener una vía interna supercargada para construir las materias primas necesarias para el geraniol. El resultado fue una nueva cepa que llamaron BYa3105.

Cuando el equipo cultivó estas nuevas células de levadura en el laboratorio, observaron una clara diferencia de comportamiento en comparación con la levadura original, no modificada. La nueva cepa produjo geraniol con éxito, alcanzando una concentración de casi 295 miligramos por litro después de dos días de crecimiento. Las cepas de levadura originales, que carecían del nuevo paquete genético, no produjeron nada de geraniol. Esto confirmó que la producción estaba directamente vinculada al nuevo gen que habían insertado. Sin embargo, los investigadores también notaron una compensación. La nueva cepa terminó con aproximadamente un 22 por ciento menos de masa total que la levadura original. A pesar de esta reducción en el tamaño final, las células permanecieron sanas y vivas, y su capacidad para almacenar grasas, un rasgo natural de esta levadura, no se vio alterada. Las células crecieron a la misma velocidad que las originales durante las etapas iniciales, lo que sugiere que los cambios genéticos no las ralentizaron mientras se dedicaban a multiplicarse.

El tiempo de la producción coincidió perfectamente con la hipótesis de los investigadores. El geraniol no apareció en grandes cantidades mientras la levadura crecía rápidamente. En cambio, la sustancia comenzó a acumularse significativamente solo después de que la tasa de crecimiento comenzara a disminuir, alcanzando su punto máximo alrededor de la marca de las 48 horas. Este patrón confirmó que el promotor hp4d estaba haciendo exactamente lo que se diseñó para hacer: permitió que la levadura construyera una gran población primero, y solo entonces encendió la maquinaria para fabricar el geraniol. Este retraso es una estrategia crucial porque evita que el producto químico tóxico se acumule mientras las células son más vulnerables, desacoplando efectivamente el crecimiento de la fábrica del proceso de fabricación del producto.

A medida que el experimento continuaba más allá de las 48 horas, la cantidad de geraniol en el matraz comenzó a disminuir. Los investigadores investigaron si esto se debía a que el producto químico se estaba evaporando o descomponiendo por sí solo. Realizaron una prueba de control con solo el producto químico en el líquido, sin ninguna levadura, y encontraron que la sustancia se mantenía estable. Esto descartó la simple evaporación o la inestabilidad química como la causa. En cambio, los datos sugirieron que las propias células de levadura estaban transformando el geraniol en otras sustancias a medida que pasaba el tiempo. El equipo también descubrió que la cantidad de azúcar disponible en el líquido jugaba un papel importante. Cuando aumentaron la concentración de azúcar, la levadura produjo más geraniol, pero solo hasta cierto punto. Añadir demasiado azúcar no condujo a un aumento proporcional en el producto final, probablemente debido a que las células desviaron su energía hacia el almacenamiento de grasa o porque las vías metabólicas se saturaron.

El estudio concluye que este enfoque es una forma prometedora de producir geraniol en un entorno de laboratorio. Al utilizar un interruptor genético específico para retrasar la producción hasta que la levadura haya terminado de crecer, el equipo logró crear una cepa que produce un producto químico valioso sin matarse a sí misma en el proceso. Aunque la cantidad final de levadura fue ligeramente menor, las células permanecieron viables y sanas, y la estrategia de producción logró minimizar el estrés causado por el producto químico tóxico. Los hallazgos resaltan que gestionar el tiempo de producción es tan importante como la propia ingeniería genética, ofreciendo un modelo para construir fábricas biológicas más robustas y eficientes para el futuro.