Engineering Yarrowia lipolytica for efficient geraniol production via hp4d promoter-driven geraniol synthase expression
यह अध्ययन *hp4d* प्रमोटर के तहत *crGES* की एक एकल प्रति को एकीकृत करके, गेरानियोल उत्पादन के लिए *Yarrowia lipolytica* स्ट्रेन BYa3105 को एक कुशल सूक्ष्मजीव मंच के रूप में स्थापित करता है, जो उत्पाद निर्माण और कोशिकीय प्रदर्शन के बीच संतुलन बनाने वाली एक विकास-विच्छेदित (growth-decoupled) जैव-संश्लेषण रणनीति के माध्यम से ~295 मिलीग्राम एल⁻¹ का टाइटर प्राप्त करता है।
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औद्योगिक विनिर्माण की दुनिया में, इत्र, खाद्य पदार्थ और दवाओं के लिए कुछ सबसे मूल्यवान सामग्रियां टेरपीन (terpenes) नामक सूक्ष्म अणु हैं। इनमें से एक सबसे अधिक वांछित जेरानियोल (geraniol) है, जो एक सुगंधित यौगिक है जो गुलाब और लेमनग्रास को उनकी विशिष्ट सुगंध देता है। सदियों से, मनुष्यों ने पौधों के विशाल क्षेत्रों को कुचलकर जेरानियोल का उत्पादन किया है, जो एक धीमी, महंगी और मौसम की अनिश्चितताओं पर निर्भर प्रक्रिया है। इसे हल करने के लिए, वैज्ञानिकों ने सूक्ष्म जगत की ओर रुख किया है, जिसमें एककोशिकीय जीवों को प्रयोगशाला में इन रसायनों का उत्पादन करने वाले छोटे कारखानों के रूप में प्रशिक्षित किया गया है। लक्ष्य एक ऐसा जैविक मेजबान खोजना है जो मजबूत, कुशल हो और इन अणुओं द्वारा जहरीला हुए बिना उन्हें बनाने में सक्षम हो।
इस क्षेत्र में एक प्रमुख चुनौती विषाक्तता (toxicity) है। जेरानियोल सहित कई मूल्यवान रसायन उन कोशिकाओं के लिए हानिकारक होते हैं जो उन्हें बनाती हैं। यदि कोई सूक्ष्मजीव बहुत अधिक मात्रा में रसायन बहुत तेज़ी से बनाता है, तो वह रसायन कोशिका की बाहरी झिल्ली को नुकसान पहुँचा सकता है, जिससे कारखाना उपयोगी होने लायक बड़ा होने से पहले ही बंद हो जाता है। इससे निपटने के लिए, शोधकर्ता अक्सर विकास चरण (growth phase) को उत्पादन चरण (production phase) से अलग करने का प्रयास करते हैं, जिससे कोशिकाओं को पहले अपनी संख्या बढ़ाने का मौका मिलता है और वे पूरी तरह स्थापित होने के बाद ही उत्पाद का निर्माण शुरू करती हैं। इसके लिए उन जेनेटिक स्विचों पर सटीक नियंत्रण की आवश्यकता होती है जो उत्पादन जीन को चालू और बंद करते हैं।
साउ पाउलो विश्वविद्यालय के शोधकर्ताओं ने एक हालिया अध्ययन में यरोविया लिपोलिटिका (Yarrowia lipolytica) नामक यीस्ट का उपयोग करके इस चुनौती का समाधान किया। यह विशेष यीस्ट इंजीनियरों के बीच इसलिए लोकप्रिय है क्योंकि यह स्वाभाविक रूप से उच्च ऊर्जा-समृद्ध अणुओं को संभालता है और बहुत मजबूत है, जो उन कठिन परिस्थितियों में जीवित रहने में सक्षम है जहाँ अन्य सूक्ष्मजीव विफल हो जाते हैं। टीम यह देखना चाहती थी कि क्या वे इस यीस्ट को एक विशिष्ट जेनेटिक स्विच का उपयोग करके कुशलतापूर्वक जेरानियोल बनाने के लिए प्रोग्राम कर सकते हैं जो यीस्ट के विकास पूरा होने तक उत्पादन में देरी करता है। उन्होंने एक शक्तिशाली जेनेटिक प्रमोटर (promoter) पर ध्यान केंद्रित किया, जो डीएनए का एक अनुक्रम है जो जीन्स के लिए डिमर स्विच (dimmer switch) की तरह कार्य करता है, जिसे hp4d प्रमोटर के रूप में जाना जाता है। मानक स्विचों के विपरीत जो जीन्स को तुरंत चालू कर देते हैं, यह अपेक्षाकृत शांत रहता है जब तक कि कोशिकाएं तेजी से बढ़ रही होती हैं, और केवल तभी सक्रिय होता है जब कोशिकाएं धीमी हो जाती हैं और विश्राम अवस्था में प्रवेश करती हैं।
शोधकर्ताओं ने मैडागास्कर पेरिविंकल (Madagascar periwinkle) पौधे से एक जीन लिया, जिसमें स्वाभाविक रूप से जेरानियोल सिंथेज़ (geraniol synthase) बनाने के निर्देश होते हैं—वह एंजाइम जो इस अणु को बनाने के लिए जिम्मेदार है। उन्होंने इस जीन को छोटा किया ताकि यह यीस्ट के भीतर बेहतर ढंग से काम कर सके और फिर इसे hp4d प्रमोटर से जोड़ा। CRISPR-Cas9 नामक एक आधुनिक जीन-एडिटिंग टूल का उपयोग करके, जो विशिष्ट स्थानों में नया डीएनए डालने के लिए आणविक कैंची की तरह कार्य करता है, उन्होंने इस नए जेनेटिक पैकेज को यीस्ट के जीनोम में एकीकृत किया। उन्होंने यीस्ट के एक ऐसे विशिष्ट स्ट्रेन को चुना जिसे पहले से ही जेरानियोल के लिए आवश्यक कच्चे माल के निर्माण हेतु एक सुपरचार्ज्ड आंतरिक मार्ग के लिए इंजीनियर किया गया था। परिणाम स्वरूप एक नया स्ट्रेन बना जिसे उन्होंने BYa3105 नाम दिया।
जब टीम ने प्रयोगशाला में इन नए यीस्ट कोशिकाओं को उगाया, तो उन्होंने मूल, अपरिवर्तित यीस्ट की तुलना में व्यवहार में स्पष्ट अंतर देखा। नया स्ट्रेन सफलतापूर्वक जेरानियोल का उत्पादन करने में सफल रहा, जिसने दो दिन के विकास के बाद लगभग 295 मिलीग्राम प्रति लीटर की सांद्रता प्राप्त की। मूल यीस्ट स्ट्रेन, जिनमें नया जेनेटिक पैकेज नहीं था, ने बिल्कुल भी जेरानियोल का उत्पादन नहीं किया। इसने पुष्टि की कि उत्पादन सीधे तौर पर उनके द्वारा डाले गए नए जीन से जुड़ा हुआ था। हालांकि, शोधकर्ताओं ने एक समझौता (trade-off) भी देखा। नया स्ट्रेन मूल यीस्ट की तुलना में लगभग 22 प्रतिशत कम कुल द्रव्यमान के साथ समाप्त हुआ। इस अंतिम आकार में कमी के बावजूद, कोशिकाएं स्वस्थ और जीवित रहीं, और वसा को संग्रहीत करने की उनकी क्षमता, जो इस यीस्ट का एक प्राकृतिक गुण है, बाधित नहीं हुई। कोशिकाएं शुरुआती चरणों के दौरान मूल कोशिकाओं की तरह ही गति से बढ़ीं, जिससे पता चलता कि जेनेटिक परिवर्तनों ने उन्हें बढ़ने के दौरान धीमा नहीं किया।
उत्पादन का समय शोधकर्ताओं की परिकल्पना (hypothesis) से पूरी तरह मेल खा गया। जब यीस्ट तेजी से बढ़ रहा था, तब जेरानियोल बड़ी मात्रा में दिखाई नहीं दिया। इसके बजाय, रासायनिक पदार्थ केवल तभी महत्वपूर्ण रूप से जमा होना शुरू हुआ जब विकास दर धीमी होने लगी, और यह 48 घंटे के आसपास अपने चरम पर पहुँचा। इस पैटर्न ने पुष्टि की कि hp4d प्रमोटर ठीक वही कर रहा था जिसके लिए इसे डिज़ाइन किया गया था: इसने यीस्ट को पहले एक बड़ी आबादी बनाने दी, और उसके बाद ही उत्पादन की मशीनरी को चालू किया। यह देरी एक महत्वपूर्ण रणनीति है क्योंकि यह 防止 (रोकती) है कि जहरीला रसायन उस समय जमा हो जाए जब कोशिकाएं सबसे अधिक संवेदनशील होती हैं, जिससे कारखाने के विकास और उत्पाद के निर्माण के बीच प्रभावी रूप से अलगाव हो जाता है।
जैसे ही 48 घंटों के बाद प्रयोग जारी रहा, फ्लास्क में जेरानियोल की मात्रा कम होने लगी। शोधकर्ताओं ने जांच की कि क्या यह रसायन के वाष्पित होने या अपने आप टूटने के कारण था। उन्होंने केवल तरल में मौजूद रसायन के साथ एक नियंत्रण परीक्षण (control test) चलाया, और पाया कि रसायन स्थिर रहा। इससे यह सिद्ध हुआ कि साधारण वाष्पीकरण या रासायनिक अस्थिरता इसका कारण नहीं थी। इसके बजाय, डेटा ने सुझाव दिया कि यीस्ट कोशिकाएं स्वयं समय के साथ जेरानियोल को अन्य पदार्थों में बदल रही थीं। टीम ने यह भी पाया कि तरल में चीनी की उपलब्धता ने एक बड़ी भूमिका निभाई। जब उन्होंने चीनी की सांद्रता बढ़ाई, तो यीस्ट ने अधिक जेरानियोल का उत्पादन किया, लेकिन एक सीमा तक। बहुत अधिक चीनी जोड़ने से अंतिम उत्पाद में आनुपातिक वृद्धि नहीं हुई, संभवतः इसलिए क्योंकि कोशिकाएं अपनी ऊर्जा वसा को संग्रहीत करने की ओर स्थानांतरित कर देती हैं या मेटाबॉलिक मार्ग संतृप्त (saturated) हो जाते हैं।
अध्ययन निष्कर्ष निकालता है कि यह दृष्टिकोण प्रयोगशाला सेटिंग में जेरानियोल बनाने का एक आशाजनक तरीका है। एक विशिष्ट जेनेटिक स्विच का उपयोग करके उत्पादन को यीस्ट के बढ़ने के बाद तक विलंबित करके, टीम ने एक ऐसा स्ट्रेन बनाने में सफलता प्राप्त की जो प्रक्रिया के दौरान खुद को मारे बिना एक मूल्यवान रसायन का उत्पादन करता है। हालांकि यीस्ट की अंतिम मात्रा थोड़ी कम थी, कोशिकाएं व्यवहार्य और स्वस्थ रहीं, और उत्पादन रणनीति ने जहरीले रसायन से होने वाले तनाव को प्रभावी ढंग से कम किया। ये निष्कर्ष इस बात पर प्रकाश डालते हैं कि उत्पादन के समय का प्रबंधन करना उतना ही महत्वपूर्ण है जितना कि स्वयं जेनेटिक इंजीनियरिंग, जो भविष्य के लिए अधिक मजबूत और कुशल जैविक कारखाने बनाने के लिए एक ब्लूप्रिंट प्रदान करता है।
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