Engineering Yarrowia lipolytica for efficient geraniol production via hp4d promoter-driven geraniol synthase expression

Dans le monde de la fabrication industrielle, certains des ingrédients les plus précieux pour les parfums, les aliments et les médicaments sont de minuscules molécules appelées terpènes. L'une des plus recherchées est le géraniol, un composé odorant qui donne aux roses et à la citronnelle leur odeur distinctive. Pendant des siècles, les humains ont récolté le géraniol en broyant de vastes champs de plantes, un processus lent, coûteux et dépendant des caprices de la météo. Pour résoudre ce problème, les scientifiques se sont tournés vers le monde microscopique, entraînant des organismes unicellulaires pour agir comme de petites usines produisant ces produits chimiques en laboratoire. L'objectif est de trouver un hôte biologique qui soit robuste, efficace et capable de produire ces molécules sans être empoisonné par elles.

Un défi majeur dans ce domaine est la toxicité. De nombreux produits chimiques précieux, y compris le géraniol, sont nocifs pour les cellules mêmes qui les fabriquent. Si un microbe produit trop de ce produit chimique trop rapidement, la substance peut endommager la membrane externe de la cellule, provoquant l'arrêt de l'usine avant qu'elle n'ait eu la chance de croître suffisamment pour être utile. Pour surmonter cela, les chercheurs tentent souvent de séparer la phase de croissance de la phase de production, permettant aux cellules de constituer d'abord leurs effectifs, puis de ne commencer la fabrication du produit qu'une fois qu'elles sont pleinement établies. Cela nécessite un contrôle précis des commutateurs génétiques qui activent et désactivent les gènes de production.

Dans une étude récente, des chercheurs de l'Université de São Paulo ont abordé ce défi en utilisant une levure appelée Yarrowia lipolytica. Cette levure particulière est une favorite des ingénieurs car elle gère naturellement des niveaux élevés de molécules riches en énergie et est très robuste, capable de survivre dans des conditions difficiles où d'autres microbes échoueraient. L'équipe voulait voir si elle pouvait programmer cette levure pour produire du géraniol efficacement en utilisant un commutateur génétique spécifique qui retarde la production jusqu'à ce que la levure ait fini de croître. Ils se sont concentrés sur un promoteur génétique puissant, une séquence d'ADN qui agit comme un variateur d'intensité pour les gènes, connu sous le nom de promoteur hp4d. Contrairement aux commutateurs standards qui activent les gènes immédiatement, celui-ci reste relativement calme pendant la phase de croissance rapide et ne s'intensifie que lorsque les cellules ralentissent et entrent dans un état de repos.

Les chercheurs ont commencé par prendre un gène provenant d'une pervenche de Madagascar, qui contient naturellement les instructions pour fabriquer la géraniol synthase, l'enzyme responsable de la création de la molécule. Ils ont taillé ce gène pour qu'il fonctionne mieux à l'intérieur de la levure et l'ont ensuite attaché au promoteur hp4d. En utilisant un outil d'édition génétique moderne connu sous le nom de CRISPR-Cas9, qui agit comme des ciseaux moléculaires pour insérer de l'ADN dans des emplacements spécifiques, ils ont intégré ce nouveau paquet génétique dans le génome de la levure. Ils ont choisi une souche spécifique de levure qui avait déjà été pré-modifiée pour posséder une voie interne surchargée pour la construction des matières premières nécessaires au géraniol. Le résultat fut une nouvelle souche qu'ils nommèrent BYa3105.

Lorsque l'équipe a cultivé ces nouvelles cellules de levure en laboratoire, elle a observé une différence claire de comportement par rapport à la levure originale, non modifiée. La nouvelle souche a produit du géraniol avec succès, atteignant une concentration de près de 295 milligrammes par litre après deux jours de croissance. Les souches de levure originales, qui manquaient le nouveau paquet génétique, ne produisaient aucun géraniol. Cela a confirmé que la production était directement liée au nouveau gène qu'ils avaient inséré. Cependant, les chercheurs ont également remarqué un compromis. La nouvelle souche s'est retrouvée avec environ 22 % de masse totale en moins que la levure originale. Malgré cette réduction de la taille finale, les cellules sont restées saines et vivantes, et leur capacité à stocker des graisses, un trait naturel de cette levure, n'a pas été perturbée. Les cellules ont grandi à la même vitesse que l'originale lors des premières étapes, suggérant que les changements génétiques ne les ont pas ralenties pendant qu'elles étaient occupées à se multiplier.

Le moment de la production correspondait parfaitement à l'hypothèse des chercheurs. Le géraniol n'est pas apparu en grandes quantités pendant que la levure croissait rapidement. Au contraire, la substance a commencé à s'accumuler de manière significative seulement après que le taux de croissance a commencé à ralentir, atteignant un pic autour de la 48ème heure. Ce schéma a confirmé que le promoteur hp4d faisait exactement ce pour quoi il avait été conçu : il a permis à la levure de construire d'abord une grande population, puis a activé la machinerie pour fabriquer le géraniol. Ce délai est une stratégie cruciale car il empêche le produit chimique toxique de s'accumuler pendant que les cellules sont les plus vulnérables, découplant ainsi efficacement la croissance de l'usine de la fabrication du produit.

Alors que l'expérience se poursuivait au-delà de 48 heures, la quantité de géraniol dans le flacon a commencé à diminuer. Les chercheurs ont cherché à savoir si cela était dû à l'évaporation ou à une décomposition de la substance. Ils ont effectué un test de contrôle avec uniquement la substance chimique dans le liquide, sans aucune levure, et ont constaté que la substance restait stable. Cela a permis d'exclure une simple évaporation ou une instabilité chimique comme cause. Au lieu de cela, les données suggéraient que les cellules de levure elles-mêmes transformaient le géraniol en d'autres substances au fil du temps. L'équipe a également découvert que la quantité de sucre disponible dans le liquide jouait un rôle majeur. Lorsqu'ils ont augmenté la concentration de sucre, la levure a produit plus de géraniol, mais seulement jusqu'à un certain point. Ajouter trop de sucre n'a pas conduit à une augmentation proportionnelle du produit final, probablement parce que les cellules ont détourné leur énergie vers le stockage des graisses ou parce que les voies métaboliques sont devenues saturées.

L'étude conclut que cette approche est un moyen prometteur de fabriquer du géraniol en laboratoire. En utilisant un commutateur génétique spécifique pour retarder la production jusqu'à ce que la levure ait fini de croître, l'équipe a réussi à créer une souche qui produit un produit chimique précieux sans s'autodétruire dans le processus. Bien que la masse finale de la levure ait été légèrement inférieure, les cellules sont restées viables et saines, et la stratégie de production a réussi à minimiser le stress causé par le produit chimique toxique. Ces résultats soulignent que la gestion du moment de la production est tout aussi importante que l'ingénierie génétique elle-même, offrant un modèle pour construire des usines biologiques plus robustes et plus efficaces pour l'avenir.