Engineering Yarrowia lipolytica for efficient geraniol production via hp4d promoter-driven geraniol synthase expression

Nel mondo della produzione industriale, alcuni degli ingredienti più preziosi per profumi, alimenti e medicinali sono minuscole molecole chiamate terpeni. Una delle più ricercate è il geraniolo, un composto fragrante che conferisce alle rose e alla citronella il loro odore distintivo. Per secoli, l'uomo ha raccolto il geraniolo schiacciando vasti campi di piante, un processo lento, costoso e dipendente dai capricci del tempo. Per risolvere questo problema, gli scienziati si sono rivolti al mondo microscopico, addestrando organismi unicellulari per agire come piccole fabbriche che producono questi prodotti chimici in un laboratorio. L'obiettivo è trovare un ospite biologico che sia robusto, efficiente e capace di produrre queste molecole senza esserne avvelenato.

Una sfida importante in questo campo è la tossicità. Molti di questi prodotti chimici preziosi, incluso il geraniolo, sono dannosi per le stesse cellule che li producono. Se un microbo produce troppo prodotto chimico troppo velocemente, la sostanza può danneggiare la membrana esterna della cellula, causando lo spegnimento della fabbrica prima che abbia la possibilità di crescere abbastanza da essere utile. Per superare questo ostacolo, i ricercatori spesso cercano di separare la fase di crescita dalla fase di produzione, permettendo alle cellule di aumentare prima il proprio numero e solo dopo iniziare a fabbricare il prodotto una volta che sono pienamente stabilite. Ciò richiede un controllo preciso sugli interruttori genetici che accendono e spengono i geni della produzione.

In uno studio recente, i ricercatori dell'Università di São Paulo hanno affrontato questa sfida utilizzando un lievito chiamato Yarrowia lipolytica. Questo particolare lievito è un preferito dagli ingegneri perché gestisce naturalmente alti livelli di molecole ricche di energia ed è molto resistente, capace di sopravvivere in condizioni difficili dove altri microbi fallirebbero. Il team voleva vedere se potevano programmare questo lievito per produrre geraniolo in modo efficiente utilizzando un interruttore genetico specifico che ritarda la produzione finché il lievito non ha terminato la crescita. Si sono concentrati su un potente promotore genetico, una sequenza di DNA che agisce come un interruttore a intensità variabile per i geni, noto come promotore hp4d. A differenza degli interruttori standard che attivano i geni immediatamente, questo rimane relativamente silenzioso durante la fase di rapida crescita e aumenta l'attività solo quando le cellule rallentano ed entrano in uno stato di riposo.

I ricercatori hanno iniziato prelevando un gene da una pianta di pervinca di Madagascar, che contiene naturalmente le istruzioni per produrre la geraniolo sintasi, l'enzima responsabile della creazione della molecola. Hanno accorciato questo gene per farlo funzionare meglio all'interno del lievito e lo hanno collegato al promotore hp4d. Utilizzando uno strumento di editing genetico moderno noto come CRISPR-Cas9, che agisce come forbici molecolari per inserire nuovo DNA in posizioni specifiche, hanno integrato questo nuovo pacchetto genetico nel genoma del lievito. Hanno scelto un ceppo specifico di lievito che era già stato pre-ingegnerizzato per avere una via interna potenziata per costruire le materie prime necessarie per il geraniolo. Il risultato è stato un nuovo ceppo che hanno chiamato BYa3105.

Quando il team ha fatto crescere queste nuove cellule di lievito in laboratorio, ha osservato una chiara differenza di comportamento rispetto al lievito originale, non modificato. Il nuovo ceppo ha prodotto con successo geraniolo, raggiungendo una concentrazione di quasi 295 milligrammi per litro dopo due giorni di crescita. I ceppi di lievito originali, che mancavano del nuovo pacchetto genetico, non producevano affatto geraniolo. Ciò ha confermato che la produzione era direttamente collegata al nuovo gene che avevano inserito. Tuttavia, i ricercatori hanno anche notato un compromesso. Il nuovo ceppo è finito con circa il 22 percento di massa totale in meno rispetto al lievito originale. Nonostante questa riduzione della dimensione finale, le cellule sono rimaste sane e vive, e la loro capacità di immagazzinare grassi, un tratto naturale di questo lievito, non è stata interrotta. Le cellule sono cresciute alla stessa velocità del lievito originale nelle prime fasi, suggerendo che i cambiamenti genetici non le hanno rallentate mentre erano impegnate a moltiplicarsi.

La tempistica della produzione ha corrisposto perfettamente all'ipotesi dei ricercatori. Il geraniolo non è apparso in grandi quantità mentre il lievito cresceva rapidamente. Invece, la sostanza chimica ha iniziato ad accumularsi significativamente solo dopo che il tasso di crescita ha iniziato a rallentare, raggiungendo il picco intorno alle 48 ore. Questo schema ha confermato che il promotore hp4d stava facendo esattamente ciò per cui era stato progettato: ha permesso al lievito di costruire prima una vasta popolazione e solo allora ha attivato il macchinario per produrre il geraniolo. Questo ritardo è una strategia cruciale perché evita che la sostanza tossica si accumuli mentre le cellule sono più vulnerabili, separando efficacementmente la crescita della fabbrica dalla produzione del prodotto.

Mentre l'esperimento proseguiva oltre le 48 ore, la quantità di geraniolo nel contenitore ha iniziato a diminuire. I ricercatori hanno indagato se ciò fosse dovuto all'evaporazione o alla decomposizione spontanea della sostanza. Hanno eseguito un test di controllo con solo la sostanza chimica nel liquido, senza alcun lievito, e hanno scoperto che la sostanza rimaneva stabile. Ciò ha escluso l'evaporazione semplice o l'instabilità chimica come causa. Invece, i dati suggerivano che le cellule di lievito stesse stavano trasformando il geraniolo in altre sostanze col passare del tempo. Il team ha anche scoperto che la quantità di zucchero disponibile nel liquido giocava un ruolo fondamentale. Quando hanno aumentato la concentrazione di zucchero, il lievito ha prodotto più geraniolo, ma solo fino a un certo punto. L'aggiunta di troppo zucchero non ha portato a un aumento proporzionale del prodotto finale, probabilmente perché le cellule hanno spostato la loro energia verso l'immagazzinamento dei grassi o perché le vie metaboliche sono diventate sature.

Lo studio conclude che questo approccio è un modo promettente per produrre geraniolo in un ambiente di laboratorio. Utilizzando un interruttore genetico specifico per ritardare la produzione fino a quando il lievito non ha terminato la crescita, il team è riuscito a creare un ceppo che produce una sostanza chimica preziosa senza uccidersi nel processo. Sebbene la massa finale del lievito fosse leggermente inferiore, le cellule sono rimaste vitali e sane, e la strategia di produzione ha minimizzato con successo lo stress causato dalla sostanza tossica. I risultati evidenziano che la gestione della tempistica della produzione è importante quanto l'ingegneria genetica stessa, offrendo un modello per costruire fabbriche biologiche più robuste ed efficienti per il futuro.