Substrate-dependent crosslinking by the cytochrome P450 from aminopyruvatide biosynthesis

La natura si è sempre affidata a un unico, elegante trucco per costruire complessi macchinari molecolari: prende una semplice sequenza di amminoacidi, i mattoni fondamentali delle proteine, e li attorciglia in anelli stretti e resistenti. Questi anelli, noti come macrocicli, sono spesso più stabili e potenti dei loro cugini a catena lineare, il che li rende strumenti preziosi per combattere le malattie. Uno degli strumenti più versatili della natura per creare questi anelli è una famiglia di enzimi chiamati citocromi P450. Presenti in organismi che vanno dai batteri agli esseri umani, questi enzimi agiscono come scultori molecolari, capaci di unire diverse parti di una catena proteica per formare nuovi legami chimici. Sebbene gli scienziati sappiano da tempo che questi enzimi possono collegare due anelli aromatici — strutture presenti in amminoacidi come la tirosina e il triptofano — per chiudere un anello, le regole esatte che governano il modo in cui scelgono quali atomi connettere sono rimaste in parte misteriose. Comprendere queste regole è cruciale perché potrebbe permettere ai ricercatori di riprogrammare questi enzimi per costruire tipi completamente nuovi di medicinali, potenzialmente mirando a malattie che gli attuali farmaci non riescono a raggiungere.

In uno studio recente, i ricercatori si sono posti l'obiettivo di mappare i confini di questa scultura enzimatica, concentrandosi su un enzima P450 specifico chiamato ApyO, coinvolto nella produzione di un prodotto naturale noto come aminopiruvatide. Questo enzima normalmente prende un peptide precursore contenente una specifica sequenza di tre lettere, tirosina-leucina-tirosina, e fonde le due unità di tirosina tra loro con un legame carbonio-carbonio per formare un anello. Il team voleva vedere se l'enzima fosse abbastanza flessibile da accettare cambiamenti nella sequenza circostante e, in tal caso, se tali cambiamenti avrebbero alterato il tipo di legame formato. Per testare questo, hanno utilizzato un metodo chiamato traduzione cell-free, che permette di sintetizzare brevi frammenti proteici in una provetta senza la necessità di cellule viventi. Questo approccio ha permesso loro di creare rapidamente decine di variazioni del peptide, sostituendo specifici amminoacidi per osservare come reagiva l'enzima.

I ricercatori hanno prima confermato che l'enzima poteva lavorare su un pezzo molto corto della proteina, di soli dieci amminoacidi, a condizione che fosse presente un residuo specifico di arginina vicino all'inizio della sequenza. Questa scoperta suggerisce che l'enzima riconosce una regione compatta del peptide piuttosto che necessitare dell'intera struttura proteica per funzionare. Quando hanno sostituito la leucina centrale nella sequenza con altri amminoacidi, l'enzima ha continuato a funzionare, ma i risultati sono stati sorprendentemente complessi. In alcuni casi, l'enzima ha prodotto due versioni diverse della stessa molecola, che apparivano identiche in massa ma si comportavano diversamente in laboratorio. Utilizzando tecniche di imaging dettagliate per osservare gli atomi all'interno di queste molecole, il team ha scoperto che l'enzima non aveva solo formato il consueto legame carbonio-carbonio. Invece, per alcune varianti, aveva formato un legame carbonio-ossigeno, collegando i due anelli di tirosina attraverso un atomo di ossigeno. In un'altra variazione, in cui un triptofano ha sostituito una delle tirosine, l'enzima ha formato un legame azoto-carbonio, connettendo gli anelli attraverso un atomo di azoto.

Questa scoperta ha rivelato una plasticità nascosta nel comportamento dell'enzima. Piuttosto che essere una macchina rigida che compie solo una specifica connessione, ApyO sembra essere sensibile alla forma e alla chimica dello spazio tra i due anelli che sta cercando di unire. Quando i ricercatori hanno cambiato l'amminoacido situato tra le due tirosine, l'enzima ha regolato la sua presa, portando a diversi esiti chimici. Lo studio ha anche dimostrato che la spettrometria di massa, uno strumento comune per pesare le molecole, non era sufficiente per distinguere tra queste diverse strutture; solo osservando la specifica disposizione degli atomi i ricercatori sono riusciti a distinguere tra i legami carbonio-carbonio, carbonio-ossigeno e azoto-carbonio. Ciò evidenzia un punto critico per la ricerca futura: assumere che un cambiamento di massa significhi sempre che si è formato lo stesso tipo di legame chimico può portare a conclusioni errate su ciò che la natura sta effettivamente costruendo.

Oltre alle sorprese strutturali, il team ha esplorato il potenziale valore medico di queste nuove molecole. Il prodotto naturale aminopiruvatide prodotto dalla via enzimatica originale contiene un gruppo chimico specifico alla sua estremità che è noto per inibire le proteasi, una classe di enzimi che degradano le proteine e che sono spesso coinvolti in processi patologici come la metastasi tumorale e l'infezione virale. I ricercatori hanno sintetizzato una versione del prodotto naturale e hanno scoperto che è un inibitore incredibilmente potente, capace di bloccare l'attività di certe proteasi a concentrazioni anche di soli 0,3 nanomolari. Quando hanno testato le nuove varianti create dagli enzimi modificati, la maggior parte ha mostrato poca o nessuna attività. Tuttavia, una variante specifica, che conteneva il legame carbonio-ossigeno, ha mostrato una modesta capacità di inibire l'enzima convertitore dell'angiotensina, un bersaglio per i farmaci per la pressione sanguigna. Sebbene questa attività fosse molto più debole rispetto al prodotto naturale, ha dimostato che i nuovi scaffold chimici potevano comunque interagire con i bersagli biologici.

Lo studio conclude che l'enzima ApyO è molto più adattabile di quanto precedentemente ipotizzato, capace di formare diversi tipi di ponti chimici a seconda dei dettagli sottili del suo substrato. Questa flessibilità suggerisce che gli scienziati potrebbero essere in grado di ingegnerizzare questi enzimi per creare una libreria diversificata di composti macrociclici, ciascuno con proprietà geometriche e chimiche uniche. Sebbene le nuove varianti testate in questo studio non abbiano immediatamente superato il prodotto naturale in termini di potenza, la capacità di generare isomeri costituzionali — molecole con gli stessi atomi ma connessioni diverse — apre una nuova via per esplorare lo spazio chimico. Il lavoro sottolinea che le regole del cross-linking enzimatico non sono fisse, ma sono un'interazione dinamica tra l'enzima e la geometria specifica del peptide che sta modificando, offrendo una strada promettente per il futuro design di terapie basate sui peptidi.