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Substrate-dependent crosslinking by the cytochrome P450 from aminopyruvatide biosynthesis

本研究表明，细胞色素 P450 酶 ApyO 展现出卓越的底物可塑性，能够催化氨基丙酮酸前体中芳香族残基之间多种类型的交联反应——包括 C-C、N-C 和 C-O 键的形成——从而生成具有强效蛋白酶抑制活性的大环肽。

原作者： Padhi, C., Nguyen, D. T., Zhu, L., Cha, L., Wald, J. W., Mitchell, D. A., van der Donk, W.

发布于 2026-09-01

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原作者： Padhi, C., Nguyen, D. T., Zhu, L., Cha, L., Wald, J. W., Mitchell, D. A., van der Donk, W.

原始论文采用 CC BY 4.0 许可（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。 ⚕️ 这是一篇未经同行评审的预印本的AI生成解释。这不是医疗建议。请勿根据此内容做出健康决定。阅读完整免责声明

自然界长期以来一直依赖一种优雅的单一技巧来构建复杂的分子机器：它将简单的氨基酸链（蛋白质的构建模块）扭转成紧密且耐用的环状结构。这些被称为大环（macrocycles）的环通常比它们的直链亲戚更稳定、更有效，使其成为对抗疾病的宝贵工具。自然界创造这些环最通用的工具之一是被称为细胞色素 P450 的酶家族。这些酶存在于从细菌到人类的各种生物体中，充当着分子雕刻师的角色，能够将蛋白质链的不同部分拼接在一起以形成新的化学键。虽然科学家们早已知道这些酶可以连接两个芳香环（存在于酪氨酸和色氨酸等氨基酸中的结构）以闭合环路，但决定它们如何选择连接哪些原子的确切规则在某种程度上仍是一个谜。理解这些规则至关重要，因为这可以让研究人员重新编程这些酶，以构建全新类型的药物，从而潜在地针对目前药物无法触及的疾病。

在最近的一项研究中，研究人员致力于绘制这种酶促雕刻的边界，重点研究了一种名为 ApyO 的特定 P450 酶，该酶参与制造一种被称为氨基丙酮酸酯（aminopyruvatide）的天然产物。这种酶通常摄取一个包含特定三字母序列（酪氨酸-亮氨酸-酪氨酸）的前体肽，并将两个酪氨酸单元通过碳-碳键融合在一起以形成一个环。团队想要观察该酶是否具有足够的灵活性，能够接受周围序列的变化，以及如果发生变化，是否会改变形成的键的类型。为了测试这一点，他们使用了一种称为无细胞翻译的方法，这种方法允许他们在试管中合成短的蛋白质片段，而无需使用活细胞。这种方法使他们能够快速创建数十种肽的变体，通过更换特定的氨基酸来观察酶的反应。

研究人员首先确认了该酶可以作用于一段非常短的蛋白质（仅十个氨基酸长），前提是在序列开始附近存在一个特定的精氨酸残基。这一发现表明，该酶识别的是肽的一个紧凑区域，而不是需要整个蛋白质结构才能发挥功能。当他们将序列中的中心亮氨酸替换为其他氨基酸时，酶继续发挥作用，但结果却出人意料地复杂。在某些情况下，该酶产生了同一种分子的两个不同版本，它们在质量上看起来完全相同，但在实验室中的表现却不同。通过使用详细的成像技术观察这些分子内的原子，团队发现该酶不仅形成了通常的碳-碳键。相反，对于某些变体，它形成了一个碳-氧键，通过一个氧原子将两个酪氨酸环连接起来。在另一种其中用色氨酸取代一个酪氨酸的变体中，该酶形成了一个氮-碳键，通过一个氮原子连接两个环。

这一发现揭示了酶行为中隐藏的塑性。ApyO 并非一个只能做出一种特定连接的僵化机器，它似乎对两个试图连接的环之间的空间形状和化学性质非常敏感。当研究人员改变位于两个酪氨酸之间的氨基酸时，酶调整了其抓取方式，导致了不同的化学结果。研究还表明，质谱仪（一种常用的称重分子工具）不足以区分这些不同的结构；只有通过观察原子的具体排列方式，研究人员才能分辨出碳-碳、碳-氧和氮-碳连接之间的区别。这强调了一个关键点，即未来的研究：假设质量的变化总是意味着形成了相同类型的化学键，可能会导致对自然界实际构建内容的错误结论。

除了结构上的惊喜，团队还探索了这些新分子的医学价值。由原始酶途径产生的天然氨基丙酮酸酯包含一个末端特定的化学基团，已知它可以抑制蛋白酶（一类分解蛋白质的酶，常参与癌症转移和病毒感染等疾病过程）。研究人员合成了一种天然产物的版本，发现它是一种极其有效的抑制剂，在低至 0.3 纳摩尔的浓度下即可停止某些蛋白酶的活性。当他们测试由修改后的酶创造的新变体时，大多数显示出几乎没有活性。然而，其中一个特定的变体（含有碳-氧键）确实表现出了对一种名为血管紧张素转换酶的酶的适度抑制能力，而该酶是血压药物的目标。虽然这种活性远低于天然产物，但它证明了这些新的化学支架仍然可以与生物靶点发生相互作用。

研究结论指出，ApyO 酶比此前认为的更具适应性，能够根据其底物的细微细节形成不同类型的化学桥梁。这种灵活性表明，科学家们可能能够通过工程化手段设计这些酶，以创造多样的大环化合物库，每个化合物都具有独特的形状和化学性质。虽然本研究测试的新变体在效力上并未立即超越天然产物，但生成同分异构体（具有相同原子但连接方式不同的分子）的能力，为探索化学空间开辟了新途径。这项工作强调了酶促交联的规则并非固定不变，而是酶与正在修改的肽的具体几何结构之间的一种动态相互作用，为未来设计基于多肽的治疗药物提供了一条充满希望的路径。

技术摘要：细胞色素 P450 在氨基丙酮酸生物合成中的底物依赖性交联作用

问题陈述
细胞色素 P450 酶是核糖体合成与翻译后修饰肽（RiPPs）生物合成中多功能的催化剂，能够通过芳香族侧链在 C−C、C−N 和 C−O 键之间形成大环支架。虽然先前的研究已经探索了通过改变直接参与交联的残基来生成新的化学结构，但对于 P450 酶对交联位点相邻残基修饰的耐受程度仍不为人所熟知。具体而言，本研究尚未系统地探究 ApyO 的底物范围，ApyO 是来自 Burkholderia thailandensis E264 的一种 P450 酶，负责在 ApyA 前体肽的 YLY 基序中交联两个酪氨酸残基（Tyr6 和 Tyr8），其研究重点在于当中间残基发生改变时，侧翼残基的保守性以及是否存在替代的连接化学类型（例如 C−O 与 C−C）。

方法论
本研究结合了生物信息学分析、计算机模拟和实验生物化学方法，旨在研究 ApyO 的底物耐受性：

生物信息学： 通过 PHI-BLAST 搜索识别了 53 个非冗余的氨基丙酮酸样前体肽，这些肽包含 YxY、WxY 和 YLW 基序。RODEO 分析确认了相应生物合成基因簇（BGCs）中存在 P450 酶。
结构建模： 使用 AlphaFold3 对 ApyO 与 ApyA 的 C 端 10 聚肽（GRMGEGYLYD）形成的复合物进行了建模。该模型识别了关键相互作用，包括针对保守 Arg1/Lys1 的亲水口袋，以及针对 Leu7 和 Met2 的疏水口袋。
无细胞表达（CFE）与诱变： 利用 CFE 系统（PURExpress）生成了截短的 ApyA 变体（10 聚体和 8 聚体）以及定点突变体（例如 R1 变体及 Y6W、Y8W、L7Y、L7W、L7F、L7I、L7V 等），并将其与纯化的 ApyO 及氧化还原伴侣共同孵育，以评估交联效率。
结构表征： 通过 LC-MS、HR-MS/MS 以及广泛的 NMR 光谱技术（1D/2D TOCSY、NOESY、HSQC、HMBC）对产物进行分析，以确定交联的连接方式。
生物活性测定： 将天然产物（脱甲基氨基丙酮酸 A）和合成变体针对一组蛋白酶（Cathepsin B、Cathepsin L、Papain、ACE、Mpro、Trypsin、Chymotrypsin）进行测试，以评估其抑制活性。

关键结果

底物范围与最低要求： 证实 ApyO 可接受 ApyA 的 C 端 10 聚体作为有效底物，测得 $k_{cat}$ 为 $1.63 \pm 0.04 \text{ min}^{-1}$ ， $K_m$ 为 $80 \pm 7 \mu\text{M}$ 。AlphaFold 模型和诱变数据表明，位置 1（位于 YLY 基序 N 端）的保守 Arg/Lys 对活性是严格必需的；将 Arg1 替换为大多数氨基酸都会消除催化活性，尽管 R1K 变体保留了较低的活性（~8% 的转化率）。相反，Leu7 残基（位于两个酪氨酸之间）对取代表现出显著的耐受性。
替代连接化学类型：
- N−C 连接： 将 Tyr6 替换为色氨酸（Y6W）会导致在色氨酸的吲哚氮（N $\epsilon$ 1）与 Tyr8 的 C $\epsilon$ 2 之间形成 N−C 键，并通过 NMR 进行了确认。
- 构型异构体（C−C 与 C−O）： 将中央的 Leu7 替换为酪氨酸（L7Y）或色氨酸（L7W）会产生两种同质异构体。结构阐明显示，其中一种异构体保留了天然的 C $\epsilon$ 2−C $\epsilon$ 2 C−C 连接，而第二种异构体则在两个酪氨酸环之间形成了非天然的 C $\epsilon$ 2−O C−O 连接。
生物活性：
- 天然产物： 脱甲基氨基丙酮酸 A（含有天然的 C−C 交联和 C 端 $\alpha$ -酮- $\beta$ -氨基酸部分）对 Cys 蛋白酶（Cathepsin L、Cathepsin B、Papain）表现出亚纳摩尔级的抑制作用（ $IC_{50}$ 0.3–0.6 nM）。
- 变体： L7Y 异构体-2（含有 C−O 连接）对 ACE（ $IC_{50}$ 1.1 $\mu\text{M}$ ）和 Papain（ $IC_{50}$ 11.7 $\mu\text{M}$ ）表现出适度的抑制作用。其他变体未显示出显著的抑制作用。研究得出结论， $\alpha$ -酮- $\beta$ -氨基酸“弹头”对于观察到的高活性至关重要，因为仅含大环支架（不含弹头）的产物仅表现出适度的活性。
下游处理的局限性： 在 E. coli 和 Burkholderia 中尝试使用全套修饰酶（ApyH、ApyI、ApyD、ApyS）处理 L7Y 变体时，出现了转化效率低下和混合物复杂的问题，导致无法分离出具有完整 $\alpha$ -酮- $\beta$ -氨基酸修饰且具有生物活性的 C−O 连接产物。

意义与主张
本文证明了 P450 酶 ApyO 在其大环化化学方面具有显著的塑性。通过改变交联位点相邻的残基（特别是 Leu7），可以在不改变交联残基本身的情况下，引导酶形成具有不同键类型（C−O 与 C−C）的构型异构体。这一发现挑战了“交联结果仅由反应残基决定”的假设，并强调了局部肽环境的重要性。

作者强调，仅靠质谱不足以表征这些产物，因为同质异构体（C−C 与 C−O）在没有全结构阐明（如 NMR）的情况下无法区分。此外，本研究确立了一个短的 10 聚体肽作为 ApyO 的最小底物，为未来的工程化改造提供了便利。虽然 C−O 连接的变体与天然产物相比仅表现出适度的蛋白酶抑制作用，但研究表明，将大环支架与 $\alpha$ -酮酸部分结合，为多样化蛋白酶抑制剂提供了一条有前景的途径，这与已知抑制剂（如 K-13 和 OF4949）具有相似之处。这项工作强调了通过微妙的序列变化来获取多样化化学空间的 RiPP 生物合成中 P450 酶的潜力。

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