Substrate-dependent crosslinking by the cytochrome P450 from aminopyruvatide biosynthesis

La naturaleza ha dependido durante mucho tiempo de un único y elegante truco para construir máquinas moleculares complejas: toma una cadena simple de aminoácidos, los bloques de construcción de las proteínas, y las retuerce en bucles apretados y duraderos. Estos bucles, conocidos como macrociclos, suelen ser más estables y potentes que sus primos de cadena lineal, lo que los convierte en herramientas valiosas para combatir enfermedades. Una de las herramientas más versátiles de la naturaleza para crear estos bucles es una familia de enzimas llamadas citocromos P450. Presentes en organismos que van desde bacterias hasta humanos, estas enzimas actúan como escultores moleculares, capaces de unir diferentes partes de una cadena proteica para formar nuevos enlaces químicos. Si bien los científicos han sabido desde hace tiempo que estas enzimas pueden vincular dos anillos aromáticos —estructuras que se encuentran en aminoácidos como la tirosina y el triptófano— para cerrar un bucle, las reglas exactas que gobiernan cómo eligen qué átomos conectar han permanecido algo misteriosas. Comprender estas reglas es crucial porque podría permitir a los investigadores reprogramar estas enzimas para construir tipos de medicinas completamente nuevos, que potencialmente ataquen enfermedades que los fármacos actuales no pueden alcanzar.

En un estudio reciente, los investigadores se propusieron mapear los límites de esta escultura enzimática, centrándose en una enzima P450 específica llamada ApyO, que está involucrada en la producción de un producto natural conocido como aminopiruvatida. Esta enzima normalmente toma un precursor peptídico que contiene una secuencia específica de tres letras, tirosina-leucina-tirosina, y fusiona las dos unidades de tirosina mediante un enlace carbono-carbono para formar un anillo. El equipo quería ver si la enzima sería lo suficientemente flexible como para aceptar cambios en la secuencia circundante y, de ser así, si esos cambios alterarían el tipo de enlace formado. Para probar esto, utilizaron un método llamado traducción libre de células, que permite sintetizar fragmentos de proteínas cortos en un tubo de ensayo sin necesidad de células vivas. Este enfoque les permitió crear rápidamente docenas de variaciones del péptido, intercambiando aminoácidos específicos para observar cómo reaccionaba la enzima.

Los investigadores primero confirmaron que la enzima podía trabajar sobre una pieza muy corta de la proteína, de solo diez aminoácidos de longitud, siempre que estuviera presente un residuo específico de arginina cerca del inicio de la secuencia. Este hallazgo sugirió que la enzima reconoce una región compacta del péptido en lugar de necesitar la estructura completa de la proteína para funcionar. Cuando intercambiaron la leucina central de la secuencia por otros aminoácidos, la enzima continuó trabajando, pero los resultados fueron sorprendentemente complejos. En algunos casos, la enzima produjo dos versiones diferentes de la misma molécula, que parecían idénticas en masa pero se comportaban de manera diferente en el laboratorio. Al utilizar técnicas de imagen detalladas para observar los átomos dentro de estas moléculas, el equipo descubrió que la enzima no solo había formado el habitual enlace carbono-carbono. En su lugar, para ciertas variantes, había formado un enlace carbono-oxígeno, vinculando los dos anillos de tirosina a través de un átomo de oxígeno. En otra variación donde un triptófano reemplazó a una de las tirosinas, la enzima formó un enlace nitrógeno-carbono, conectando los anillos a través de un átomo de nitrógeno.

Este descubrimiento reveló una plasticidad oculta en el comportamiento de la enzima. En lugar de ser una máquina rígida que solo realiza una conexión específica, la ApyO parece ser sensible a la forma y la química del espacio entre los dos anillos que intenta unir. Cuando los investigadores cambiaron el aminoácido situado entre las dos tirosinas, la enzima ajustó su agarre, lo que condujo a diferentes resultados químicos. El estudio también mostró que la espectrometría de masas, una herramienta común para pesar moléculas, no era suficiente para distinguir entre estas diferentes estructuras; solo observando la disposición específica de los átomos pudieron los investigadores notar la diferencia entre los enlaces carbono-carbono, carbono-oxígeno y nitrógeno-carbono. Esto resalta un punto crítico para la investigación futura: asumir que un cambio en la masa siempre significa que se ha formado el mismo tipo de enlace químico puede conducir a conclusiones incorrectas sobre lo que la naturaleza está construiendo realmente.

Más allá de las sorpresas estructurales, el equipo exploró el valor médico potencial de estas nuevas moléculas. El producto natural aminopiruvatida producido por la vía enzimática original contiene un grupo químico específico en su extremo que es conocido por inhibir las proteasas, una clase de enzimas que descomponen las proteínas y que a menudo están implicadas en procesos de enfermedades como la metástasis cancerosa y la infección viral. Los investigadores sintetizaron una versión del producto natural y descubrieron que era un inhibidor increíblemente potente, deteniendo la actividad de ciertas proteasas a concentraciones tan bajas como 0,3 nanomolar. Cuando probaron las nuevas variantes creadas por las enzimas modificadas, la mayoría mostró poca o ninguna actividad. Sin embargo, una variante específica, que contenía el enlace carbono-oxígeno, mostró una capacidad modesta para inhibir una enzima llamada enzima convertidora de angiotensina, que es un objetivo para la medicación de la presión arterial. Aunque esta actividad fue mucho más débil que la del producto natural, demostró que los nuevos andamiajes químicos aún podían interactuar con objetivos biológicos.

El estudio concluye que la enzima ApyO es mucho más adaptable de lo que se pensaba anteriormente, capaz de formar diferentes tipos de puentes químicos dependiendo de los detalles sutiles de su sustrato. Esta flexibilidad sugiere que los científicos podrían ser capaces de diseñar estas enzimas para crear una biblioteca diversa de compuestos macrocíclicos, cada uno con formas y propiedades químicas únicas. Aunque las nuevas variantes probadas en este estudio no superaron inmediatamente al producto natural en potencia, la capacidad de generar isómeros constitucionales —moléculas con los mismos átomos pero diferentes conexiones— abre una nueva vía para explorar el espacio químico. El trabajo subraya que las reglas del entrecruzamiento enzimático no son fijas; son una interacción dinámica entre la enzima y la geometría específica del péptido que está modificando, ofreciendo un camino prometedor para el futuro diseño de terapéuticas basadas en péptidos.