Substrate-dependent crosslinking by the cytochrome P450 from aminopyruvatide biosynthesis

Die Natur hat sich lange auf einen einzigen, eleganten Trick verlassen, um komplexe molekulare Maschinen zu bauen: Sie nimmt eine einfache Kette von Aminosäuren, den Bausteinen von Proteinen, und verdreht sie zu engen, widerstandsfähigen Schleifen. Diese Schleifen, bekannt als Makrozyklen, sind oft stabiler und potenter als ihre geradkettigen Verwandten, was sie zu wertvollen Werkzeugen im Kampf gegen Krankheiten macht. Eines der vielseitigsten Werkzeuge der Natur zur Erzeugung dieser Schleifen ist eine Familie von Enzymen namens Cytochrom-P450. Diese Enzyme, die in Organismen von Bakterien bis hin zu Menschen vorkommen, fungieren als molekulare Bildhauer, die in der Lage sind, verschiedene Teile einer Proteinkette zusammenzufügen, um neue chemische Bindungen zu bilden. Während Wissenschaftler schon seit geraumer Zeit wissen, dass diese Enzyme zwei aromatische Ringe – Strukturen, die in Aminosäuren wie Tyrosin und Tryptophan vorkommen – miteinander verknüpfen können, um eine Schleife zu schließen, blieben die genauen Regeln, nach denen sie entscheiden, welche Atome sie verbinden, etwas mysteriös. Das Verständnis dieser Regeln ist entscheidend, da es Forschern ermöglichen könnte, diese Enzyme umzuprogrammieren, um völlig neue Arten von Medikamenten herzustellen, die potenziell Krankheiten angreifen können, die aktuelle Medikamente nicht erreichen können.

In einer kürzlich durchgeführten Studie versuchten Forscher, die Grenzen dieser enzymatischen Bildhauerei abzubilden, wobei sie sich auf ein spezifisches P450-Enzym namens ApyO konzentrierten, das an der Herstellung eines Naturprodukts namens Aminopyruvatid beteiligt ist. Dieses Enzym nimmt normalerweise ein Vorläuferpeptid, das eine spezifische Dreiersequenz Tyrosin-Leucin-Tyrosin enthält, und fügt die beiden Tyrosin-Einheiten mit einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung zusammen, um einen Ring zu bilden. Das Team wollte sehen, ob das Enzym flexibel genug wäre, um Veränderungen in der umgebenden Sequenz zu akzeptieren, und falls ja, ob diese Veränderungen die Art der gebildeten Bindung beeinflussen würden. Um dies zu testen, verwendeten sie eine Methode namens zellfreier Translation, die es ermöglicht, kurze Proteinfragmente in einem Reagenzglas zu synthetisieren, ohne lebende Zellen zu benötigen. Dieser Ansatz erlaubte es ihnen, schnell Dutzende von Variationen des Peptids zu erstellen, indem sie spezifische Aminosäuren austauschten, um zu sehen, wie das Enzym reagierte.

Die Forscher bestätigten zunächst, dass das Enzym an einem sehr kurzen Proteinstück arbeiten konnte, das nur zehn Aminosäuren lang war, vorausgesetzt, ein spezifischer Arginin-Rest in der Nähe des Sequenzanfangs war vorhanden. Dieser Befund deutete darauf hin, dass das Enzym eine kompakte Region des Peptids erkennt, anstatt die gesamte Proteinstruktur zu benötigen, um zu funktionieren. Als sie das zentrale Leucin in der Sequenz durch andere Aminosäuren ersetzten, arbeitete das Enzym weiterhin, aber die Ergebnisse waren überraschend komplex. In einigen Fällen produzierte das Enzym zwei verschiedene Versionen desselben Moleküls, die in der Masse identisch erschienen, sich aber im Labor unterschiedlich verhielten. Durch den Einsatz detaillierter Bildgebungstechniken, um die Atome innerhalb dieser Moleküle zu betrachten, entdeckte das Team, dass das Enzym nicht nur die übliche Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung gebildet hatte. Stattdessen hatte es für bestimmte Varianten eine Kohlenstoff-Sauerstoff-Bindung gebildet, die die beiden Tyrosinringe über ein Sauerstoffatom verband. In einer weiteren Variation, bei der ein Tryptophan ein Tyrosin ersetzte, bildete das Enzym eine Stickstoff-Kohlenstoff-Bindung, die die Ringe über ein Stickstoffatom verband.

Diese Entdeckung offenbarte eine verborgene Plastizität im Verhalten des Enzyms. Anstatt eine starre Maschine zu sein, die nur eine spezifische Verbindung herstellt, scheint ApyO empfindlich auf die Form und Chemie des Raums zwischen den beiden Ringen zu reagieren, die es verbinden möchte. Wenn die Forscher die Aminosäure änderten, die zwischen den beiden Tyrosinen saß, passte das Enzym seinen Griff an, was zu unterschiedlichen chemischen Ergebnissen führte. Die Studie zeigte auch, dass die Massenspektrometrie, ein gängiges Werkzeug zum Wiegen von Molekülen, nicht ausreichte, um zwischen diesen verschiedenen Strukturen zu unterscheiden; nur durch die Betrachtung der spezifischen Anordnung der Atome konnten die Forscher den Unterschied zwischen den Kohlenstoff-Kohlenstoff-, Kohlenstoff-Sauerstoff- und Stickstoff-Kohlenstoff-Verknüpfungen feststellen. Dies unterstreicht einen kritischen Punkt für die zukünftige Forschung: Die Annahme, dass eine Änderung der Masse immer bedeutet, dass die gleiche Art von chemischer Bindung entstanden ist, kann zu falschen Schlussfolgerungen darüber führen, was die Natur tatsächlich baut.

Über die strukturellen Überraschungen hinaus untersuchte das Team den medizinischen Nutzen dieser neuen Moleküle. Das natürliche Aminopyruvatid, das durch den ursprünglichen Enzymweg produziert wird, enthält eine spezifische chemische Gruppe an seinem Ende, die dafür bekannt ist, Proteasen zu hemmen – eine Klasse von Enzymen, die Proteine abbauen und oft an Krankheitsprozessen wie der Krebsmetastasierung und Virusinfektionen beteiligt sind. Die Forscher synthetisierten eine Version des Naturprodukts und fanden heraus, dass es ein unglaublich potenter Inhibitor ist, der die Aktivität bestimmter Proteasen bereits bei Konzentrationen von nur 0,3 Nanomolar stoppt. Als sie die neuen Varianten testeten, die durch die modifizierten Enzyme erzeugt wurden, zeigten die meisten eine geringe oder gar keine Aktivität. Eine spezifische Variante jedoch, die die Kohlenstoff-Sauerstoff-Bindung enthielt, zeigte eine moderate Fähigkeit, das Enzym Angiotensin-Converting-Enzym zu hemmen, welches ein Ziel für Blutdruckmedikamente ist. Obwohl diese Aktivität weit schwächer als die des Naturprodukts war, demonstrierte sie, dass die neuen chemischen Gerüste dennoch mit biologischen Zielstrukturen interagieren konnten.

Die Studie kommt zu dem Schluss, dass das ApyO-Enzym weita viel anpassungsfähiger ist als bisher angenommen, und in der Lage ist, je nach den subtilen Details seines Substrats unterschiedliche Arten von chemischen Brücken zu bilden. Diese Flexibilität legt nahe, dass Wissenschaftler diese Enzyme manipulieren könnten, um eine vielfältige Bibliothek von makrozyklischen Verbindungen zu erschaffen, die jeweils über einzigartige Formen und chemische Eigenschaften verfügen. Während die in dieser Studie getesteten neuen Varianten die Potenz des Naturprodukts nicht unmittelbar übertrafen, eröffnet die Fähigkeit, Konstitutionsisomere – Moleküle mit denselben Atomen, aber unterschiedlichen Verbindungen – einen neuen Weg zur Erforschung des chemischen Raums. Die Arbeit unterstreicht, dass die Regeln der enzymatischen Vernetzung nicht starr sind, sondern ein dynamisches Zusammenspiel zwischen dem Enzym und der spezifischen Geometrie des modifizierten Peptids darstellen, was einen vielversprechenden Pfad für das zukünftige Design peptidgebundener Therapeutika bietet.