Substrate-dependent crosslinking by the cytochrome P450 from aminopyruvatide biosynthesis

De natuur heeft lang vertrouwd op één elegante truc om complexe moleculaire machines te bouwen: ze neemt een eenvoudige reeks aminozuren, de bouwstenen van eiwitten, en draait deze tot strakke, duurzame lussen. Deze lussen, bekend als macrocycli, zijn vaak stabieler en krachtiger dan hun lineaire tegenhangers, wat ze waardevolle instrumenten maakt in de strijd tegen ziekten. Een van de meest veelzijdige instrumenten van de natuur voor het creëren van deze lussen is een familie van enzymen genaamd cytochroom P450's. Deze enzymen, die voorkomen in organismen variërend van bacteriën tot mensen, fungeren als moleculaire beeldhouwers die in staat zijn om verschillende delen van een eiwitketen aan elkaar te klikken om een nieuwe chemische binding te vormen. Hoewel wetenschappers al geruime tijd weten dat deze enzymen twee aromatische ringen — structuren die te vinden zijn in aminozuren zoals tyrosine en tryptofaan — kunnen koppelen om een lus te sluiten, zijn de exacte regels die bepalen hoe ze kiezen welke atomen ze verbinden, enigszins mysterieus gebleven. Het begrijpen van deze regels is cruciaal, omdat het onderzoekers in staat zou kunnen stellen om deze enzymen te herprogrammeren om geheel nieuwe soorten medicijnen te bouwen, die potentieel ziekten kunnen aanpakken waar huidige medicijnen niet bij kunnen.

In een recente studie probeerden onderzoekers de grenzen van dit enzymatische beeldhouwwerk in kaart te brengen, waarbij ze zich concentreerden op een specifiek P450-enzym genaamd ApyO, dat betrokken is bij de productie van een natuurlijk product genaamd aminopyruvatide. Dit enzym neemt normaal gesproken een precursor-peptide die een specifieke drieletterige sequentie bevat, tyrosine-leucine-tyrosine, en voegt de twee tyrosine-eenheden samen met een koolstof-koolstofbinding om een ring te vormen. Het team wilde zien of het enzym flexibel genoeg zou zijn om veranderingen in de omliggende sequentie te accepteren en, zo ja, of die veranderingen het type binding zouden veranderen. Om dit te testen, gebruikten ze een methode genaamd celvrije translatie, waardoor ze korte eiwitfragmenten in een reageerbuis kunnen synthetiseren zonder levende cellen nodig te hebben. Deze aanpak stelde hen in staat om snel tientallen variaties van het peptide te maken, waarbij ze specifieke aminozuren vervingen om te zien hoe het enzym reageerde.

De onderzoekers bevestigden eerst dat het enzym kon werken op een zeer kort stukje van het eiwit, slechts tien aminozuren lang, mits een specifieke arginine-residue nabij het begin van de sequentie aanwezig was. Deze bevinding suggereerde dat het enzym een compact gebied van het peptide herkent in plaats van de volledige eiwitstructuur nodig te hebben om te functioneren. Wanneer ze de centrale leucine in de sequentie vervingen door andere aminozuren, bleef het enzym werken, maar de resultaten waren verrassend complex. In sommige gevallen produceerde het enzym twee verschillende versies van hetzelfde molecuul, die in massa identiek leken maar in het laboratorium anders gedrag vertoonden. Door gebruik te maken van gedetailleerde beeldvormingstechnieken om naar de atomen binnen deze moleculen te kijken, ontdekte het team dat het enzym niet alleen de gebruikelijke koolstof-koolstofbinding had gevormd. In plaats daarvan had het voor bepaalde varianten een koolstof-zuurstofbinding gevormd, waarbij de twee tyrosine-ringen via een zuurstofatoom werden verbonden. In een andere variatie, waarbij een tryptofaan een tyrosine verving, vormde het enzym een stikstof-koolstofbinding, waarbij de ringen via een stikstofatoom werden verbonden.

Deze ontdekking onthulde een verborgen plasticiteit in het gedrag van het enzym. In plaats van een rigide machine die slechts één specifieke verbinding maakt, lijkt ApyO gevoelig te zijn voor de vorm en chemie van de ruimte tussen de twee ringen die het probeert te verenigen. Wanneer de onderzoekers het aminozuur dat tussen de twee tyrosines zit veranderden, paste het enzym zijn grip aan, wat leidde tot verschillende chemische uitkomsten. De studie toonde ook aan dat massaspectrometrie, een veelgebruikt hulpmiddel om moleculen te wegen, niet voldoende was om onderscheid te maken tussen deze verschillende structuren; alleen door te kijken naar de specifieke rangschikking van atomen konden de onderzoekers het verschil zien tussen de koolstof-koolstof-, koolstof-zuurstof- en stikstof-koolstofverbindingen. Dit benadrukt een cruciaal punt voor toekomstig onderzoek: aannemen dat een verandering in massa altijd betekent dat er een bepaald type chemische binding is gevormd, kan leiden tot onjuiste conclusies over wat de natuur daadwerkelijk aan het bouwen is.

Naast de structurele verrassingen onderzochten het team ook de potentiële medische waarde van deze nieuwe moleculen. Het natuurlijke aminopyruvatide, geproduceerd door het oorspronkelijke enzymatische pad, bevat een specifieke chemische groep aan het uiteinde die bekend staat als een remmer van proteases, een klasse enzymen die eiwitten afbreken en vaak betrokken zijn bij ziekteprocessen zoals kankermetastase en virale infectie. De onderzoekers synthetiseerden een versie van het natuurlijke product en vonden dat het een ongelooflijk krachtige remmer was, die de activiteit van bepaalde proteases stopzet bij concentraties zo laag als 0,3 nanomolair. Toen ze de nieuwe varianten testten die door de gemodificeerde enzymen waren gemaakt, vertoonden de meeste weinig tot geen activiteit. Echter, één specifieke variant, die de koolstof-zuurstofbinding bevatte, vertoonde een bescheiden vermogen om het enzym angiotensin-converterend enzym te remmen, een doelwit voor bloeddrukmedicatie. Hoewel deze activiteit veel zwakker was dan die van het natuurlijke product, toonde het aan dat de nieuwe chemische structuren nog steeds interactie kunnen hebben met biologische doelwitten.

De studie concludeert dat het ApyO-enzym veel aanpasbaarder is dan voorheen gedacht, in staat om verschillende soorten chemische bruggen te vormen afhankelijk van de subtiele details van zijn substraat. Deze flexibiliteit suggereert dat wetenschappers deze enzymen kunnen modificeren om een diverse bibliotheek van macrocyclische verbindingen te creëren, elk met unieke vormen en chemische eigenschappen. Hoewel de nieuwe varianten die in deze studie zijn getest, de natuurlijke variant niet onmiddellijk in potentie overtroffen, opent het vermogen om constitutionele isomeren te genereren — moleculen met dezelfde atomen maar andere verbindingen — een nieuwe weg voor het verkennen van de chemische ruimte. Het werk onderstreept dat de regels van enzymatische crosslinking niet vaststaan; het is een dynamische wisselwerking tussen het enzym en de specifieke geometrie van het peptide dat het aanpast, wat een veelbelovend pad biedt voor de toekomstige ontwikkeling van peptide-gebaseerde therapieën.