Isolation and identification of non-tuberculous mycobacteria from dead edible fish in Iran

Problematica
I micobatteri non tubercolari (NTM) sono patogeni opportunisti ambientali ampiamente presenti negli ambienti acquatici e terrestri, che pongono rischi sia per i pesci che per gli esseri umani. La micobatteriosi dei pesci (tubercolosi dei pesci) è una malattia granulomatosa che colpisce oltre 200 specie di pesci, portando spesso a letargia, crescita scarsa, organomegalia e mortalità. Sebbene Mycobacterium marinum, M. chelonae e M. fortuitum siano noti come cause comuni, i metodi tradizionali di identificazione fenotipica sono dispendiosi in termini di tempo, complessi e spesso non riescono a fornire un'identificazione precisa a livello di specie. Inoltre, il potenziale zoonotico di questi patogeni evidenzia la necessità di un rilevamento rapido e accurato nei pesci commestibili, in particolare nei sistemi di acquacoltura dove possono rappresentare una fonte di infezione per l'uomo.

Metodologia
Lo studio ha investigato la presenza e l'identificazione di NTM in 123 campioni di pesci commestibili morti raccolti da vari stagni di allevamento ittico a Ilam, nella parte occidentale dell'Iran, tra gennaio 2024 e febbraio 2025. Tre pesci sani per ogni stagno sono serviti come controlli.

• Elaborazione del campione: I campioni di tessuto sono stati omogeneizzati, colorati con Ziehl-Neelsen (ZN) per i bacilli acido-resistenti e decontaminati utilizzando NaOH e HCl.
• Coltura: I sedimenti sono stati inoculati su terreno Lowenstein-Jensen (LJ) e incubati sia a 25°C che a 37°C per 8 settimane.
• Caratterizzazione fenotipica: Le colonie positive sono state valutate in base alle caratteristiche morfologiche, al tasso di crescita, alla produzione di pigmenti e ai test biochimici (produzione di niacina, riduzione del nitrato, catalasi, ureasi e attività dell'arilsolfatasi) seguendo i protocoli CDC.
• Identificazione molecolare: Il DNA è stato estratto utilizzando un kit commerciale. L'identificazione della specie è stata eseguita tramite amplificazione PCR e sequenziamento di due geni housekeeping: un frammento di 441 bp del gene hsp65 e un frammento di 750 bp del gene rpoB.
• Analisi: I risultati del sequenziamento sono stati analizzati tramite BLASTn contro i database NCBI. Gli alberi filogenetici sono stati costruiti utilizzando l'approccio Neighbor-Joining (NJ) con il modello di distanza Kimura two-parameter (K2P) e 1000 replicazioni bootstrap nel software MEGA 7.

Risultati Chiave

• Prevalenza: Gli NTM sono stati isolati da 19 dei 123 campioni (15,44%). Tutti i campioni di controllo sono risultati negativi.
• Segni clinici: Tra i pesci infetti, il 47,36% (9/19) presentava ulcerazioni cutanee, il 26,32% (5/19) perdita di scaglie, il 5,26% (1/19) grave deperimento e il 21,05% (4/19) non mostrava segni clinici.
• Caratteristiche di crescita: Il 73,68% (14/19) degli isolati erano Micobatteri a Crescita Rapida (RGM), mentre il 26,32% (5/19) erano Micobatteri a Crescita Lenta (SGM).
• Discrepanze di identificazione: I metodi fenotipici hanno identificato 14 isolati come il complesso M. fortuitum ma non sono riusciti a distinguere le specie in 7 casi (53,8% del complesso).
• Risultati molecolari: Il sequenziamento dei geni hsp65 e rpoB ha permesso una precisa discriminazione delle specie. Il gene hsp65 ha dimostrato valori di similarità più elevati rispetto a rpoB. La distribuzione finale delle specie è stata:
  • Mycobacterium fortuitum: 9 isolati (47,36%)
  • Mycobacterium chelonae: 5 isolati (26,32%)
  • Mycobacterium marinum: 5 isolati (26,32%)
    (Nota: Il testo dell'abstract contiene un errore tipografico che elenca "M. fortuitum" due volte nel riepilogo; i risultati dettagliati e la Tabella 1 chiariscono la presenza di M. chelonae).

Significato e Rivendicazioni
Gli autori affermano che questo studio fornisce dati quantitativi più completi sulla frequenza e la distribuzione di specifici segni clinici associati alla tubercolosi dei pesci rispetto alle precedenti descrizioni qualitative. La ricerca sottolinea i limiti dei metodi fenotipici, che non sono riusciti a raggiungere l'identificazione a livello di specie per una parte significativa degli isolati, mentre i metodi molecolari si sono dimostrati significativamente più accurati.

Lo studio conclude che i pesci commestibili nella regione ospitano specie di NTM (M. fortuitum, M. chelonae e M. marinum) che sono patogene sia per i pesci che per gli esseri umani. Di conseguenza, gli autori sottolineano l'importanza di implementare metodi di rilevamento molecolare rapidi e accurati nei sistemi di acquacoltura per mitigare le potenziali minacce alla salute dei consumatori umani e migliorare la gestione delle malattie nell'allevamento ittico. Il documento richiede ulteriori studi molecolari per comprendere meglio l'epidemiologia di questi patogeni.