Isolation and identification of non-tuberculous mycobacteria from dead edible fish in Iran

문제 정의
비결핵 항산균(NTM)은 수생 및 육상 환경에 널리 존재하는 환경적 기회감염병으로, 물고기와 인간 모두에게 위험을 초래한다. 어류 마이코박테리아증(어류 결핵)은 200종 이상의 어류에 영향을 미치는 육아종성 질환으로, 흔히 무기력증, 성장 저하, 장기 비대 및 폐사를 유발한다. Mycobacterium marinum, M. chelonae, M. fortuitum가 흔한 원인균으로 알려져 있으나, 전통적인 표현형 식별 방법은 시간이 오래 걸리고 복잡하며 종 수준의 정밀한 식별을 제공하지 못하는 경우가 빈번하다. 또한, 이러한 병원체의 인수공통 감염 가능성은 특히 이들이 인간에 대한 감염원으로 작용할 수 있는 양식 시스템 내 식용 어류의 신속하고 정확한 탐지의 필요성을 강조한다.

연구 방법
본 연구는 2024년 1월부터 2025년 2월 사이 이란 서부 일람(Ilam) 지역의 다양한 양식 연못에서 수집된 123개의 죽은 식용 어류 시료를 대상으로 NTM의 존재 여부와 식별을 조사하였다. 각 연못당 3마리의 건강한 물고기를 대조군으로 사용하였다.

• 시료 처리: 조직 시료를 균질화하고, Ziehl-Neelsen(ZN) 염색을 통해 항산균을 확인하였으며, NaOH와 HCl을 사용하여 탈균 처리를 하였다.
• 배양: 침전물을 Lowenstein-Jensen(LJ) 배지에 접종하고 25°C와 37°C에서 8주 동안 배양하였다.
• 표현형 특성 분석: 양성 콜로니는 형태학적 특징, 성장 속도, 색소 생성 및 CDC 프로토콜에 따른 생화학적 테스트(니아신 생성, 질산염 환원, 카탈라아제, 우레아제 및 아릴 설파타제 활성)를 바탕으로 평가하였다.
• 분자 식별: 상용 키트를 사용하여 DNA를 추출하였다. 종 식별은 hsp65 유전자의 441-bp 단편과 rpoB 유전자의 750-bp 단편을 증폭하는 PCR을 통해 수행되었다.
• 분석: 시퀀싱 결과는 NCBI 데이터베이스의 BLASTn을 통해 분석되었다. 계통수는 MEGA 7 소프트웨어를 사용하여 Kimura two-parameter (K2P) 거리 모델과 1000회의 부트스트랩 반복을 적용한 Neighbor-Joining (NJ) 방식으로 구축되었다.

주요 결과

• 유병률: 123개 시료 중 19개(15.44%)에서 NTM이 분리되었다. 모든 대조군 시료는 음성이었다.
• 임상 징후: 감염된 어류 중 47.36%(9/19)는 피부 궤양을, 26.32%(5/19)는 비늘 손실을, 5.26%(1/19)는 심한 소모성 악액질을 보였으며, 21.05%(4/19)는 임상 징후를 보이지 않았다.
• 성장 특성: 분리된 균주 중 73.68%(14/19)는 빠르게 성장하는 마이코박테리아(RGM)였으며, 26.32%(5/19)는 느리게 성장하는 마이코박테리아(SGM)였다.
• 식별 불일치: 표현형 방법은 14개의 분리 균주를 M. fortuitum 복합체로 식별하였으나, 7개 사례(복합체의 53.8%)에서는 종을 구별하는 데 실패하였다.
• 분자적 발견: hsp65 및 rpoB 유전자의 시퀀싱을 통해 정밀한 종 구분이 가능하였다. hsp65 유전자가 rpoB보다 더 높은 유사도 값을 나타냈다. 최종 종 분포는 다음과 같다:
  • Mycobacterium fortuitum: 9개 분리 균주 (47.36%)
  • Mycobacterium chelonae: 5개 분리 균주 (26.32%)
  • Mycobacterium marinum: 5개 분리 균주 (26.32%)
    (참고: 초록 텍스트에는 요약 부분에 "M. fortuitum"이 두 번 기재되는 오타가 있으나, 상세 결과와 표 1은 M. chelonae의 존재를 명확히 하고 있음).

의의 및 주장
저자들은 본 연구가 기존의 질적 기술과 비교하여 어류 결핵과 관련된 특정 임상 징후의 빈도 및 분포에 대해 더 포괄적인 정량적 데이터를 제공한다고 주장한다. 본 연구는 표현형 방법의 한계를 강조하였는데, 이는 상당 부분의 분리 균주에 대해 종 수준의 식별을 달學하지 못했으나, 분자적 방법은 현저히 더 높은 정확도를 입증하였다.

본 연구는 해당 지역의 식용 어류가 어류와 인간 모두에게 병원성을 가진 NTM 종(M. fortuitum, M. chelonae, M. marinum)을 보유하고 있다고 결론짓는다. 따라서 저자들은 인간 소비자에게 미칠 수 있는 잠재적 건강 위협을 완화하고 어류 양식의 질병 관리를 개선하기 위해 양식 시스템 내에서 신속하고 정확한 분자 탐지 방법을 도입하는 것이 중요하다고 강조한다. 또한, 이들 병원체의 역학을 더 잘 이해하기 위해 추가적인 분자 연구를 촉구한다.