Isolation and identification of non-tuberculous mycobacteria from dead edible fish in Iran

问题陈述
非结核分枝杆菌（NTM）是广泛存在于水生和陆生环境中的环境性机会致病菌，对鱼类和人类均构成风险。鱼类分枝杆菌病（鱼类结核病）是一种肉芽肿性疾病，影响超过 200 种鱼类，常导致鱼类出现精神萎靡、生长缓慢、器官肿大和死亡现象。虽然海洋分枝杆菌（Mycobacterium marinum）、切洛纳分枝杆菌（M. chelonae）和福特穆分枝杆菌（M. fortuitum）是已知的常见病原体，但传统的表型鉴定方法耗时、复杂，且往往无法提供精确的物种水平鉴定。此外，这些病原体的人畜共患潜力凸显了在食用鱼类中进行快速准确检测的必要性，特别是在可能成为人类感染源的水产养殖系统中。

研究方法
本研究调查了 2024 年 1 月至 2025 年 2 月期间，在伊朗西部伊拉姆省（Ilam）不同鱼类养殖池塘中采集的 123 份死亡食用鱼样本中 NTM 的存在情况及鉴定情况。每个池塘取三条健康鱼作为对照。

• 样本处理： 将组织样本匀质化，使用齐尔-尼尔森（ZN）染色检测抗酸杆菌，并使用 NaOH 和 HCl 进行除菌处理。
• 培养： 将沉积物接种于低文森特-詹森（Lowenstein-Jensen, LJ）培养基中，并在 25°C 和 37°C 下培养 8 周。
• 表型特征鉴定： 根据 CDC 方案，通过形态学特征、生长速率、色素产生以及生化实验（尼酸产生、硝酸盐还原、过氧化氢酶、脲酶和芳基硫酸酯酶活性）对阳性菌落进行评估。
• 分子鉴定： 使用商业试剂盒提取 DNA。通过 PCR 扩增并对两个管家基因的片段进行测序进行物种鉴定，分别为 hsp65 基因的 441-bp 片段和 rpoB 基因的 750-bp 片段。
• 分析： 使用 BLASTn 在 NCBI 数据库中进行序列比对。利用 MEGA 7 软件，采用近邻连接法（Neighbor-Joining, NJ）和 Kimura 两参数（K2P）距离模型构建系统发育树，并进行 1000 次 Bootstrap 重复计算。

主要结果

• 流行率： 在 123 份样本中，有 19 份样本（15.44%）分离出了 NTM。所有对照样本均为阴性。
• 临床症状： 在受感染的鱼类中，47.36%（9/19）表现出皮肤溃疡，26.32%（5/19）表现出鳞片脱落，5.26%（1/19）表现出严重消瘦，21.05%（4/19）未显示临床症状。
• 生长特性： 73.68%（14/19）的分离株为快速生长分枝杆菌（RGM），26.32%（5/19）为缓慢生长分枝杆菌（SGM）。
• 鉴定差异： 表型方法将 14 个分离株鉴定为福特穆分枝杆菌复合群，但在 7 例情况中（该复合群的 53.8%）未能区分物种。
• 分子发现： 对 hsp6ales 和 rpoB 基因的测序实现了精确的物种区分。hsp65 基因展现出比 rpoB 更高的相似性值。最终物种分布为：
  • 福特穆分枝杆菌 (Mycobacterium fortuitum)：9 株（47.36%）
  • 切洛纳分枝杆菌 (Mycobacterium chelonae)：5 株（26.32%）
  • 海洋分枝杆菌 (Mycobacterium marinum)：5 株（26.32%）
    （注：摘要文本在总结中两次列出“M. fortuitum”存在笔误；详细结果和表 1 明确了 M. chelonae 的存在）。

意义与主张
作者声称，与以往的定性描述相比，本研究提供了关于与鱼类结核病相关的特定临床症状频率和分布更全面的定量数据。研究强调了表型方法的局限性，即无法对相当比例的分离株实现物种水平的鉴定，而分子方法被证明显著更加准确。

研究结论认为，该地区的食用鱼携带了对鱼类和人类均具有致病性的 NTM 物种（M. fortuitum、M. chelonae 和 M. marinum）。因此，作者强调有必要在水产养殖系统中实施快速准确的分子检测方法，以减轻对人类消费者的潜在健康威胁，并改善鱼类养殖的疾病管理。论文呼吁开展进一步的分子研究，以更好地了解这些病原体的流行病学特征。